背景与目的MicroRNA(miRNA)是一类长度为21-25个核糖核苷酸的非编码内源性单链小RNA分子。早在1993年,Lee等人首次在线虫体内发现第一个miRNA并将其命名为lin-4,并且发现该miRNA能在翻译水平通过抑制核蛋白lin-14的表达来调节线虫的幼虫发育进程。此后不断有新的miRNAs被分离、鉴定出来,截止2012年4月,已发现了2109余种人类miRN As (http://www.mirbase.org),随着研究的不断深入,相信还将有更多新的miRNAs被研究发现。血浆中的循环miRNAs可能是一类具有潜在临床应用价值的新型生物标志物。目前对正常人和不同疾病患者血浆中miRNAs的检测结果表明,miRNAs分子同已知的循环核酸(DNA和RNA)一样,广泛存在于正常人和不同疾病患者的血浆中,尽管目前血浆循环miRNAs的功能和来源尚未完全阐明,但是通过对其表达谱的研究,发现血浆循环miRNAs具有很强的细胞、组织和疾病的特异性,这些特异性的表达miRNAs分子,既是疾病发展及变化过程功能研究的基础,又是很好的生物标志物,能够在早期反应出疾病的发展和转归。另一方面,miRNAs在血浆中的稳定性非常较好,含量保持相对稳定,更进一步地显示了血浆循环miRNAs作为理想的生物标志物所需的某些特征。因此,深入研究不同疾病状态下血浆循环miRNAs表达谱的异常表达,可能有助于疾病诊断及预后的评估。冠心病是人类最主要的死亡原因之一,也是消耗巨大医疗资源的疾病之一。经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention, PCI)是冠心病治疗的重大进展之一。PCI已被广泛应用于冠心病患者的治疗,其临床疗效确切,通过冠状动脉血运重建可明显改善患者症状,提高了患者的生活质量和生存率。但是,由于PCI术中对病变斑块的挤压、促凝组织的暴露以及支架等器械置入,有可能促进血小板的激活、血栓形成,引发支架内血栓,心肌梗死和死亡等临床终点事件。在临床终点事件上,10%-15%的患者在1年内会出现等心脑血管事件,包括脑卒中和主要不良心脏事件(Major Adverse Cardiac Events, MACE包括心源性死亡、心肌梗死和再次血运重建)。基于目前血浆循环miRNAs的研究理论发现和新进展,我们有理由推测,在PCI术后患者中,患者血浆循环miRNAs的种类及其表达丰度可能处于一个相对稳定、平衡的状态,而当患者出现心脏功能的不良反应的改变、代谢异常或器质性病变等因素可能会直接或间接地破坏患者体内体液循环miRNAs的稳态,表现为特定某些循环miRNAs的表达水平变化。因此,本研究将建立一套成熟可靠的血浆miRNAs提取检测的方法,利用人体血浆循环miRNAs表达水平的变化,分析其与PCI术后患者发生主要心脏不良事件的关联性,试图寻找预测PCI术患者预后的生物标记物,为患者的早期干预和治疗提供临床参考,并且在发现不同预后患者血浆某些miRNAs表达差异的基础上,通过体外细胞实验探讨miR-126对血管内皮细胞的调节作用,进一步阐明miRNAs的生物学功能。第一章：血浆循环microRNAs定量技术的建立目的：通过建立稳定可靠的血浆循环miRNA的定量技术,为后续研究的进行提供技术基础。方法：收集健康志愿者外周血样标本,离心分离血浆标本,建立成熟稳定的提取和检测方法。血浆miRNA提取方法方面,采用Trizol LS试剂盒提取血浆总RNA。采用Agilent2100毛细血管电泳的方法,检测总RNA中存在小片度的RNA分子。血浆miRNA检测方法方面,外加一定浓度梯度的线虫种属cel-miR-39,检验提取检测方法的特异性；琼脂糖凝胶电泳实验定性鉴别miRNAs扩增片段,观察扩增产物的特异性。结果：前期10例健康志愿者所提取血浆总RNA的浓度在1-8ng/μL。外加cel-miR-39mimincs一定浓度梯度至目标血浆中,分别加入的量为0pmol、2pmol、20pmol、200pmol、2000pmol,通过Trizol LS提取血浆总RNA, RT-qPCR检测cel-miR-39的浓度,CT值呈现一定浓度的梯度变化,其CT值分别为>40、30.33、28.99、26.71、24.00,验证Trizol LS提取方法的有效性；设计特异性引物检测内源性miR-16和miR-126在血浆中的表达,发现miR-16的表达丰度较高且比较稳定,miR-126的表达丰度较低；琼脂糖凝胶电泳鉴别miR-16、cel-miR-39和miR-126扩增片段,均在70-80bp左右出现单一条带,符合预期引物设计扩增的大小,其扩增产物的特异性较好。结论：血浆中存在小分子片段的游离小RNA,通过本研究方法进行提取和检测具有可行性,血浆miRNA的提取及定量检测方法比较可靠。第二章：血浆循环MicroRNAs与PCI术后心脏主要不良事件的相关性研究目的：收集PCI术后患者血样标本,对患者进行为期一年的随访,检测候选miRNAs (miR-126、miR-21、miR-26b、miR-223、miR-16)在患者中的表达,分析其表达水平与治疗预后的关联性,结合临床资料分析寻找发生联合终点事件的危险因素。方法：在前期建立的有效提取和检测方法之后,收集PCI术后患者血样标本480例,提取血浆总RNA,利用特异性引物,采用荧光定量PCR检测患者候选miRNAs(miR-126、miR-21、miR-26b、miR-223、miR-16)的表达,采用四分位法将各miRNAs表达水平分为三组[Q1：低表达组(25%)；Q2：中表达组(50%)；Q3：高表达组(25%)],并同时对患者进行一年的随访调查,记录患者的临床资料和联合终点事件的发生情况,分析候选miRNAs与PCI术患者治疗预后的相关性；并且根据临床资料的收集,进一步通过多因素COX回归模型分析血浆miRNAs表达水平和各临床因素对PCI术治疗预后的影响。结果：(1)最终纳入本试验分析共480名病人,术后1年内随访明确发生支架内血栓4例(0.83%)例,发生MACE事件24例(5.00%),通过进一步检测候选miRNAs (miR-126、miR-21、miR-26b、miR-223、miR-16)在患者中的表达,5个候选miRNAs均能在人体血浆中检测,miRNAs各组表达水平基线资料均衡。(2)通过将发生支架内血栓作为评价终点,采用Log-rank单因素分析发现,miR-16三组表达水平间整体累计生存率具有统计学差异(x2=6.077,P=0.048),进一步通过两两比较分析发现,与Q2组相比,Q3累计生存率下降,具有统计学差异(χ2=6.096,P=0.014)；miR-126、miR-21、miR-26b、miR-223各表达水平间整体累计生存率没有统计学差异(P>0.05)；(3)通过将发生联合终点事件作为评价终点,采用Log-rank单因素分析发现,miR-126各表达水平间整体累计生存率有统计学差异(χ2=6.154,P=0.046),进一步通过两两比较分析发现,与Q1组比相比,Q3组累计生存率显著降低,具有统计学差异(X2=6.460, P=0.011); miR-223各表达水平间整体累计生存率有统计学差(χ2=8.218,P=0.016),进一步通过两两比较分析发现,与Q1组相比,Q3组累计生存率显著降低(χ2=6.450,P=0.011),与Q2组比较,Q3组累计生存率显著降低(χ2=4.436,P=0.035)；miR-21、miR-26b、miR-16各表达水平间整体累计生存率没有统计学差异(P>0.05)；(4)多因素入选COX回归模型与联合终点事件预后相关的因素为：miR-21表达水平、miR-223表达水平、高血压、左室射血分数、低密度脂蛋白,其中,高血压、miR-223表达升高,低密度脂蛋白表达降低、miR-21表达降低、左室射血分数降低为术后心血管事件发生的危险因素。结论：候选miRNAs均在人体血浆中表达,血浆循环miR-126和miR-223高表达水平的患者,其联合终点累计生存率明显降低,血浆循环miR-126和miR-223的表达水平有希望成为预测PCI术后患者联合终点事件发生的潜在生物标记物,通过早期的积极干预及治疗,有望减少术后心脏不良反应事件的发生第三章：miR-126对血管内皮细胞的影响目的：体外培养细胞实验初步探究miR-126对血管内皮细胞功能的影响。方法：体外培养血管内皮细胞EAHY-926,外源合成miR-126的模拟体miR-126mimics和其抑制剂剂miR-126inhibitor,采用阳离子介导的转染方式,将miR-126mimics和niR-126inhibitor转染进细胞,分析miRNA-126对血管内皮细胞功能的影响。采用转染negative control作为阴性对照,转染36h后提取细胞总RNA,荧光定量PCR方法检测VEGF mRNA的表达,同时,裂解细胞提取总蛋白,western bloting检测VEGF蛋白的表达情况。结果：体外实验培养EAHY-926血管内皮细胞,通过抑制miR-126和上调miR-126在细胞中的表达,发现miR-126对血管内皮细胞血管内皮生长因子(VEGF)存在调节作用。转染miR-126inhibitor50nM36h后,细胞VEGF mRNA及蛋白水平各组间有统计学差异(F=46.128, P<0.001; F=44.959, P<0.001),进一步通过两两比较,与阴性对照组相比,miR-126inhibitor VEGF mRNA及蛋白水平均显著上调(P<0.001,P<0.001)；转染miR-126mimics50nM36h后,细胞VEGF mRNA及蛋白水平各组间有统计学差异(F=96.542,P<0.001; F=15.425,P=0.004),进一步通过两两比较,与阴性对照组相比,1niR-126mimics VEGF mRNA及蛋白水平均显著下调(P<0.001,P=0.003)。结论：生物学信息学预测VEGF可能是miR-126的靶基因,miR-126可能通过作用于VEGF的3"UTR端而起到抑制基因表达的作用。在血管内皮细胞中抑制miR-126的表达, VEGF mRNA及蛋白表达水平明显上调,过表达niR-126, VEGF mRNA及蛋白表达水平明显下调,miR-126与VEGF存在负向调控作用。