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目的与背景:肺癌是全球范围内致死率最高的恶性肿瘤,绝大多数肺癌患者在接受临床治疗时已处于中、晚期。现今临床上治疗肺癌常用的手段包括全身放疗与化疗,虽具有一定的疗效但不可避免治疗周期长、副作用大、费用昂贵等缺点。早期诊断与早期治疗可以大幅提升肺癌患者的5年生存率,成为改善肺癌预后的关键。目前已知并用于肺癌早期诊断的血清肿瘤标志物不能作为临床检测指标,是由于其较低的特异性与敏感性。因此,应用SELEX技术从肺癌血清中筛选已知或未知的血清肿瘤标志物核酸适配体已成为目前肺癌早期诊断和治疗的研究热点。核酸适配体是一类从体外筛选得到的小分子寡聚核苷酸(DNA或RNA),比表面积大且有丰富的三维空间结构,能与相应的靶物质高亲和力、强特异性结合。与抗体相比,适配体可从体外大量合成、重复性强、稳定性高且易于储存。因此,本文利用双向热循环消减SELEX技术从肺癌血清和非癌血清中筛选肺癌和非癌血清标志物的核酸适配体,建立一种对肺癌的检测方法,从而提高诊断和治疗效率。方法:(1)筛选介质的选择通过酶联免疫吸附测定实验:(1)对比环氧基化琼脂磁珠与羧基化琼脂磁珠偶联蛋白的能力;(2)对磁珠进行酸、碱活化处理后检测环氧基化琼脂磁珠与羧基化琼脂磁珠偶联蛋白的能力的变化;(3)优化环氧基化琼脂磁珠储存介质和储藏时间。(2)血清标志物核酸适配体的筛选通过双向热循环消减SELEX筛选:(1)血清靶标及靶标磁珠的制备:收集20例肺癌Ⅰ期患者的血样及20例正常体格检查者的血样,每管吸取等量的血清进行混合,处理后制备为肺癌混合血清靶标(+)与非癌混合血清靶标(-),制备混合血清的目的是为了消除个体差异。制备好的靶标包被环氧基化琼脂磁珠制备靶标磁珠;(2)阴性靶标磁珠消减ssDNA初级文库:使用等量的阴性靶标磁珠进行3次消减SELEX筛选,目的是去除与阴性靶标特异性结合的核酸序列;(3)肺癌血清核酸适配体与非癌血清核酸适配体的热循环消减SELEX筛选:以阳性靶标磁珠为正筛靶,阴性为反筛靶,使用经过阴性靶标磁珠消减筛选的ssDNA文库为初级库,得到阳性ssDNA。以阴性靶标磁珠为正筛靶,阳性为反筛靶,使用初级ssDNA文库为初级库,得到阴性ssDNA。通过链霉亲和素磁珠分离法制备次级ssDNA文库,重复筛选步骤,共进行了19轮筛选;(3)适配体的测序及结构分析经高通量测序得到肺癌血清核酸适配体41条,非癌血清核酸适配体40条,分别从其中挑选出4条高丰度序列对其进行结构分析。(4)制作检测试剂并进行临床验证4条肺癌适配体高丰度序列与4条非癌适配体高丰度序列进行合成后制作检测试剂A、B,收集50例肺癌血清、50例非癌血清,分别与检测试剂A、B进行结合,通过计算检测试剂A、B分别与2种血清样品结合的ΔCt值之差获得检测试剂检出样品阳性率。结果:(1)通过检测确定环氧基化琼脂磁珠为筛选介质,环氧基化琼脂磁珠宜保存于环氧氯丙烷内且现用现酸化。(2)对第19轮筛选出特异性最强的阴、阳性ssDNA进行高通量测序,各挑选出4条高丰度序列。通过RNA Structure软件进行适配体的结构分析,得到的核酸适配体多以茎环结构(Loop-stem)为主。(3)通过检测试剂检测检出肺癌阳性率为90%,非癌阳性率为82%,检出总阳性率为86%。结论:通过双向热循环消减SELEX技术筛选出肺癌、非癌血清高特异性核酸适配体并设计临床检验方法进行验证,结果表明检测灵敏度高,特异性强,为肺癌的早期诊断和治疗提供了新的方法。