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再生障碍性贫血(Aplastic Anemia, AA)是由于多种原因导致的造血干细胞数量减少和功能异常,造血微环境损伤,全血细胞减少,临床以贫血、感染和出血为主要表现的临床综合症。近年研究发现中医药可延缓AA的病程进展,引起了国内外专家的关注。AA时免疫功能异常,主要表现在T淋巴细胞功能亢进,IFN-y主要是由CD4+和CD8+细胞中Thl和Tcl细胞分泌,AA时其水平显著升高,Thl和Tcl细胞分泌功能增强；转录因子T-bet和GATA-3特异性调控Th0细胞分化Thl、Th2细胞,是Thl/Th2细胞转换开关作用的关键因子；T-bet在树突状细胞(mDCs)分泌的IL-12作用下,通过信号转导和转录激活因子1(STAT1)途径促进Th0向Thl极化,使后者分泌IFN-yγ、TNF-a等I型淋巴因子；在IL-4作用下,Th0细胞通过STAT6途径促进GATA-3高表达,使Th0向Th2极化,后者分泌IL-4、IL-5、IL-13等II型淋巴因子；AA时T-bet的异位表达激活IFN-γ基因并诱导内源IFN-γ的产生,同时IFN-γ可诱导CD8+T细胞、NK细胞和成熟B细胞表达T-bet, T-bet通过抑制GATA-3表达,阻断GATA-3与Th2细胞因子间相互作用,而诱导已分化成熟的Th2向Thl逆向转化,从而使Th1(分泌IFN-γ)/Th2(分泌IL-4)失衡和T-bet/GATA-3表达异常。本研究采用苯和环磷酰胺联合建立AA大鼠模型,应用流式细胞术、放射免疫法、免疫组织化学、Western blot和RT-PCR方法,探讨补肾益髓生血法对AA大鼠TFN-γ/T-bet信号通路作用机制,为AA“肾藏精”理论的研究提供实验依据。目的：动物实验：采用苯(benzene)与环磷酰胺(Cyclophosphamide)联合诱导AA大鼠,以康力龙组为实验对照药物,观察补肾益髓生血法对AA大鼠的药效学作用,流式细胞术检测T淋巴系统CD3、CD4、CD8、CD4/CD8表达,放射免疫法检测血清中IFN-yγ、TNF-a.IL-2、IL-4、IL-5、IL-10细胞因子；免疫组织化学检测IFN-γ、T-bet、GATA-3蛋白表达；Western blot、RT-PCR检测AA大鼠骨髓IFN-γ、T-bet、GATA-3蛋白及mRNA表达。方法：1.补肾益髓生血法对苯与环磷酰胺诱导AA大鼠药效学的影响：清洁级SD大鼠85只,随机分为正常组10只,造模组75只,造模组皮下隔天注射苯(1ml/kg)7周,取材前2周连续隔天腹腔注射环磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)(25mg/kg)3次,建立再生障碍性贫血大鼠模型。第三周后灌胃前,按体质量随机分为模型组、康力龙组、益髓生血组、温肾生血组和滋肾生血组。观察大鼠一般状态、体质量。第七周处死大鼠,股动脉取血检测外周血RBC、WBC、HGB、PLT。血涂片瑞氏染色,观察血细胞形态；股骨取骨髓涂片,瑞氏染色观察骨髓细胞形态；取股骨制备骨髓悬液,倒置显微镜计数骨髓有核细胞数量。摘取大鼠脾组织,HE染色观察病理形态变化。2.流式细胞术：检测外周血CD3、CD4、CD8、CD4/CD8表达；放射免疫法检测血清中IFN-γ、TNF-a、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10细胞因子的表达。3.免疫组织化学：检测AA大鼠脾组织中IFN-γ、T-bet、GATA-3蛋白表达。4.Western blot:检测AA大鼠骨髓IFN-γ、T-bet、GATA-3蛋白表达。5RT-PCR:检测AA大鼠骨髓IFN-γ、T-bet、GATA-3mRNA表达。6.实验数据用SPSS17.0进行统计学处理。结果：1补肾益髓生血法对苯和环磷酰胺诱导AA大鼠药效学影响1.1一般状态：经过补肾益髓生血法治疗后,大鼠精神状态变好,皮毛光泽度恢复,饮食饮水增加,排尿排便量增多。1.2体质量：与模型组比较,正常组大鼠体质量增长明显,有显著统计学差异(P<0.01)；益髓生血组、温肾生血组、滋肾生血组体质量均有不同程度增长(P<0.01)。1.3外周血象：与正常组比较,模型组大鼠RBC、WBC、HGB降低(P<0.01),PLT应激性升高；与模型组比较,各治疗组RBC、WBC、HGB均显著性增多(P<0.05,P<0.01)；与康力龙组相比,滋肾生血组WBC显著性增多(P<0.05)；滋肾生血组疗效更优。1.4血涂片：模型组与正常组相比,红细胞呈散状分布,通透性降低,白细胞减少,退化细胞较常见；经过治疗后,红细胞通透性有所改善,血细胞数量增加,且益髓生血组、滋肾生血组疗效更优。1.5骨髓涂片：模型组大鼠脂肪滴明显增多,有核细胞减少,红系、粒系、巨核系细胞均降低,出现非造血细胞等；经过治疗后,脂肪滴减少,细胞增多,且益髓生血组、滋肾生血组疗效更优。1.6骨髓有核细胞数：模型组骨髓有核细胞显著减少,经过治疗后,有核细胞数显著增多,各组与模型组比较,均有统计学差异(P<0.01),且益髓生血组相对较好。1.7脾组织HE染色：模型组大鼠脾组织淋巴小结不明显,红髓白髓边界模糊；经过治疗后,淋巴小结趋于正常,红髓白髓边界清晰。2补肾益髓生血法对苯和环磷酰胺诱导AA大鼠免疫功能机制的影响2.I流式细胞术：检测CD3、CD4、CD8,模型组大鼠CD4显著降低(P<0.01)CD8显著升高(P<0.01),CD4/CD8显著降低(P<0.01),与模型组相比,滋肾生血组明显优于益髓、温肾生血组(P<0.01)。2.2血清检测：模型组大鼠血清IFN-γ、TNF-.IL-2显著升高(P<0.01),与模型组相比,各治疗组IFN-γ、IL-2、TNF-α均显著降低(P<0.01)；模型组IL-4、IL-5、IL-10显著降低(P<0.01),与模型组相比,各治疗组IL-4、IL-5、IL-10均显著升高(P<0.05,P<0.01)。3补肾益髓生血法对苯和环磷酰胺诱导AA大鼠脾组织IFN-γ、T-bet. GATA-3蛋白表达的影响免疫组织化学显示：正常组大鼠脾组织中有少量IFN-γ表达。模型组大鼠脾组织中IFN-γ、T-bet表达强阳性。与模型组比较,治疗组IFN-γ、T-bet表达明显减少,差异有统计学意义(P<0.01),且益髓生血组、滋肾生血组表达量明显少于温肾生血组；正常组大鼠脾组织中有大量GATA-3表达。模型组大鼠脾组织中GATA-3表达减少。与模型组比较,治疗组GATA-3表达明显增多,差异有统计学意义(P<0.01),且益髓生血组、滋肾生血组表达量明显多于温肾生血组。4补肾益髓生血法对苯和环磷酰胺诱导AA大鼠骨髓IFN-γ、T-bet、GATA-3蛋白与mRNA表达的影响4.1Western blot:正常组大鼠骨髓中IFN-γ、T-bet蛋白表达明显低于模型组,有显著统计学差异(p<0.01)；治疗组大鼠骨髓中IFN-γ、T-bet蛋白表达明显低于模型组,有显著统计学差异(p<0.01)；滋肾生血组相对益髓生血组和温肾生血组疗效更佳。与正常组比,模型组GATA-3蛋白表达显著减少(p<0.01)；各治疗组与模型组比较,GATA-3蛋白表达均增加。4.2RT-PCR:正常组大鼠骨髓中IFN-γ、T-bet mRNA表达明显低于模型组,均有显著统计学差异(p<0.01)；治疗组大鼠骨髓中IFN-γ、T-bet mRNA表达明显低于模型组,有显著统计学差异(p<0.01)；滋肾生血组相对益髓生血组和温肾生血组疗效更佳。正常组大鼠骨髓中GATA-3mRNA表达明显高于模型组,有统计学差异(p<0.05)。结论：1.补肾益髓生血法可以改善AA大鼠的一般状态,增加AA大鼠体质量,明显减轻AA大鼠骨髓及脾组织病理损害,增加外周血WBC、RBC、HGB,增加骨髓有核细胞的数量,对AA大鼠骨髓造血功能有一定的保护作用。补肾益髓生血法中滋肾生血组对AA大鼠一般状态的改善作用显著,优于益髓生血组和温肾生血组。2.补肾益髓生血法可以降低AA大鼠CD8,增加CD4、CD4/CD8值。经过治疗后,滋肾生血组、益髓生血组明显优于温肾生血组；补肾益髓生血法可降低AA大鼠血清细胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-a水平,增加细胞因子IL-4、IL-5、IL-10水平,对AA大鼠免疫功能有一定的调节作用,且滋肾生血组疗效优于益髓生血组、温肾生血组。3.补肾益髓生血法改善AA大鼠骨髓造血功能、调节其免疫机制、延缓AA病程进展的作用,可能是通过调控脾组织和骨髓IFN-γ/T-bet相关信号转导通路而实现的。本实验研究为“肾藏精,精生髓,髓生血”中医理论提供了实验依据。