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食品腐败变质严重威胁食品安全,是目前我国食品安全的主要问题。羊肉中富含丰富的蛋白质、脂肪和水等物质而易于微生物生长,因此微生物污染被认为是频繁引起羊肉腐败最主要的因素。所以控制微生物污染成为控制羊肉安全的主要途径。以前由于人工合成防腐剂价格低廉,所以在食品防腐保鲜中应用广泛,但随着生活质量和需求的提高,人们逐渐认识到人工防腐剂在影响食品风味、使用安全性方面存在缺陷,所以天然防腐剂作为无毒无害且来源广泛受到了极大的关注。本文对通过对某羊屠宰场的屠宰环境及熟制品加工车间进行微生物检测和鉴定,选取三株优势腐败菌比较各优势腐败菌对熟制羊肉的致腐能力。为了抑制羊肉中的腐败菌生长,从实验室一株产细菌素的Lactobacilluscrisiatus K313出发,通过PCR技术得到细菌素Helveticin-M基因全长。将其构建入表达载体pCNCH中,并转入Escherichia coli BL21中融合表达。将纯化的细菌素Helveticin-M作用于羊肉中主要的腐败菌,通过观察指示腐败菌的表面形态内部结构等研究细菌素的作用方式。最后通过超声波辅助抑菌剂处理羊肉中分离的芽孢,以期达到控制羊肉中腐败菌生长的效果。本文具体研究内容及结果如下:1)本试验通过对江苏省苏州市具有代表性的某羊屠宰场的屠宰环境及熟制品加工车间进行微生物检测,重点对熟制品加工过程中包括接触面(接触托盘、接触台面)和清洗前后的生肉与煮制后的肉进行微生物检测,确定熟制品加工过程中污染菌群的分布。所污染的腐败菌主要为芽孢杆菌、腐生葡萄球菌、变形杆菌、金黄杆菌和微杆菌等,根据各菌落分布与生长状况,选取三株主要污染菌Bacillussp.M1、S.saprophyticus. M7、Bacillus sp.M9 接种熟制羊肉,通过对熟制羊肉的感官评定、pH、菌落总数、TVB-N值和腐败代谢产物产量因子的测定来鉴定它们对熟制羊肉的致腐能力。最终得出Bacillussp.M1和Ssaprophyticus. M7的致腐能力显著高于Bacillussp.M9,且菌株Bacillus sp.M1的致腐能力略高于S.saprophyticus M7 。2)前期研究发现L.cr spatusK313的发酵液对羊肉中主要腐败菌S.saprophyticusM7有较强的抑制作用,推测L.crispatL. K313可能合成一种细菌素,起到杀死S.saprophyticus M7的作用。通过对已测序卷曲乳杆菌进行序列分析发现,L.crispatus K313编码Helveticin-like细菌素,因此本文通过简并引物克隆扩增Helveticin-like的保守区,随后利用Tail-PCR扩增保守区的上下游序列,得到基因的全长,命名为Helveticin-M。利用表达载体pCNCH,将Helveticin-M基因转入E. coliBL21中融合表达。重组菌在18℃,经1 mmol/L的IPTG诱导过夜后,得到融合蛋白条带。镍柱纯化融合蛋白后,用500mmol/L的高浓度咪唑洗脱可以收集到单一组分的融合蛋白,经电泳检测显示其纯度较高。3 )通过 SEM 和 TEM 观察细菌素 Helveticin-M对Ssaprophytic s M7、Staphylococcusaureus J1 和 Entterobacter cloaacae C5 细菌外部形态和内部结构的影响,通过测定胞内外ATP、紫外吸收物质含量和共聚焦扫描电镜观察细菌素对膜渗透性的影响,后用流式细胞仪检测细胞群体死亡情况,最后检测膜电势的变化进一步探讨Helveticin-M的抑菌机理。试验结果表明细菌素通过增加指示菌细胞的通透性造成细胞死亡,通透性的改变导致了 ATP和紫外吸收物质等的流出,并引起膜电势差△φ的耗散。并且细菌素对三种指示菌的抑制效果各不相同,其中对S.aureus J1的抑制效果最明显,对S.saprophyticusM7和E.cloacae C5的抑制效果微弱,通过透射电镜结果观察,原因可能是S.saprophyticusM7较S.aureus J1细胞壁较厚,而E.cloacaae C5细胞外有一层外膜层使细菌素进入细胞内部存在障碍。4)超声波处理羊肉中的芽孢,当处理功率为17.9 W/g,处理时间为90min时杀灭Bacillus cereusM1芽孢效果最好。即选定此条件为最佳处理时间和功率。在最适功率和时间下,添加浓度分别为0.2mg/mL的Helveticin-M、0.64 mg/mL的聚赖氨酸和10 mg/mL的苯乳酸,超声波辅助抑菌剂杀灭芽孢的效果不显著,不能有效地杀灭芽孢。所以通过萌发剂处理芽孢,使其变为营养体,结果表明,添加萌发剂后超声波更易杀灭芽孢。