药物洗脱支架(DES)是介入心脏病学的重要进展,DES使支架内再狭窄率由裸金属支架时代的20-30%下降到10%左右,然而DES轻度但有统计学意义地增加了极晚期血栓形成的发生率。其原因可能与不能降解的多聚物涂层引起的炎症或过敏反应有关；也可能与DES携载的抗细胞增殖药物有关,这些药物有效地抑制了支架置入术后血管平滑肌细胞过度增生,但同时也抑制了血管内皮细胞再生,延迟内皮愈合,从而增加支架内血栓的风险。人们期待研发出既能有效抑制平滑肌细胞增生,又对内皮细胞再生无明显影响的药物作为DES携载的药物。双环铂是继卡铂、顺铂后应用于临床抗肿瘤治疗的第三代铂类制剂,由北京兴大科学系统公司开发,是我国具有完全自主知识产权的化学Ⅰ类抗癌新药,双环铂的研究目前尚处于实验室研究和Ⅲ期临床研究阶段,现有资料表明,其抗癌疗效好,毒性低。我们拟研究其对平滑肌细胞及内皮细胞增生的影响,探讨作为支架携载药物的可能性。目前尚无双环铂对正常或良性增生的组织、细胞影响研究的文献报道。目的本研究通过体外实验,培养人主动脉平滑肌细胞(HASMC)和人主动脉内皮细胞(HAEC),MTS法检测不同浓度的双环铂对HASMC和HAEC增殖的影响,通过流式细胞仪检测不同浓度双环铂对HASMC和HAEC细胞周期的影响,探讨其可能的作用机制,旨在评价新药双环铂在防治支架置入术后再狭窄方面的潜在价值。在分子水平上,通过检测双环铂干预后HASMC和]HAEC细胞增殖核抗原PCNA,促凋亡蛋白Bax,抗凋亡蛋白Bcl-2,探讨双环铂在增殖和凋亡方面对HASMC和HAEC的影响。方法一、MTS法检测双环铂对HASMC和]HAEC增殖的影响通过体外扩增、培养HASMC和HAEC细胞株。10μg/ml,1μg/ml,100ng/ml双环铂干预培养HASMC,10μg/ml,1μg/ml双环铂干预培养HAEC,药物干预24小时、48小时、72小时,MTS法检测细胞增殖活性,计算细胞增殖抑制率,探讨双环铂的对HASMC和HAEC抑制增殖作用与时间、浓度的关系。双环铂100μg/ml起倍比稀释到0.39μg/ml共9个浓度组,干预培养HASMC72小时,双环铂200μg/ml起倍比稀释到1.56μg/ml共8个浓度组,干预培养HAEC72小时,MTS法检测细胞增殖活性,以log(双环铂浓度)与细胞生长率为变量作图,得出双环铂对HASMC和HAEC的半数抑制率IC50。双环铂浓度分别为10μg/ml,1μg/ml,100ng/ml,10ng/ml,1ng/ml,干预培养HASMC和HAEC72小时,使用雷帕霉素作为阳性对照药物,MTS法检测细胞增殖活性。使用SPSS10.0软件,单因素方差分析法进行统计分析,探求双环铂对HASMC和HAEC抑制增殖的最小有效浓度。二、流式细胞仪检测双环铂对HASMC和HAEC细胞周期的影响HASMC和HAEC接种24小时后,无血清培养24小时进行细胞周期同步化,HASMC分为6组,分别为正常对照组,雷帕霉素1ng/ml阳性对照组,双环铂1μg/ml组,100g/ml组,10ng/ml组,1ng/ml组。HAEC分为6组,分别为正常对照组,雷帕霉素10ng/ml组,双环铂10μg/ml组,1μg/ml组,100ng/ml组,10ng/ml组。药物干预培养48小时后,收集细胞,低温固定,碘化丙啶(PI)单染,通过流式细胞仪检测细胞周期变化。三、免疫印迹法(Western Blot)检测双环铂对细胞增殖蛋白PCNA和凋亡蛋白Bax, Bcl-2表达的影响HASMC和HAEC接种培养24小时后,改用无血清培养基培养24小时,HASMC分为6组,分别加入双环铂1μg/ml,100ng/ml,10ng/ml,1ng/ml,阳性对照组加入1ng/ml雷帕霉素,正常对照组予含2%血清的SMCM培养。HAEC分为6组,分别加入双环铂10μg/ml,1μg/ml,100ng/ml,10ng/ml,阳性对照组加入lOng/ml雷帕霉素,正常对照组予含有5%血清的ECM培养。药物干预48小时,提取细胞总蛋白。Western Blot法分别检测HASMC和HAEC的细胞增殖核抗原PCNA,促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达情况。结果一、双环铂对HASMC和HAEC增殖的影响对于HASMC,双环铂10μg/ml组干预1天,2天,3天的增殖抑制率分别为16%,39%,75%,1μg/ml组增殖抑制率分别为13%,13%,27%,100ng/ml组增殖抑制率分别为11%,9%,20%。对于HAEC,双环铂10μng/ml干预1天,2天,3天的增殖抑制率分别为6.41%,11.05%,14.83%,1μg/ml组干预HAEC增殖抑制率分别为1.35%,0.60%,1.3%。双环铂对HASMC和HAEC的半数抑制浓度(IC50)分别为3.47μg/ml,72.44μg/ml,两者相差20.88倍。双环铂浓度分别为10μg/ml,1μg/ml,100ng/ml,10g/ml,1ng/ml时,干预培养HASMC和HAEC3天,10ng/ml以上浓度HASMC增殖受到明显抑制(P<0.05), lng/ml时双环铂对HASMC无明显增殖抑制(P=0.83)；在10μg/ml以上浓度时HAEC增殖受到明显抑制(P<0.001),双环铂浓度在1ng/ml-1μg/ml时,对HAEC无明显增殖抑制作用(P>0.05),双环铂对HAEC的最小有效抑制浓度较对HASMC的最小有效抑制浓度高1000倍。阳性对照药物雷帕霉素在1ng/ml时,即表现出对HASMC和HAEC的抑制增殖作用,相同浓度下,对HAEC抑制作用稍弱。二、双环铂对HASMC和HAEC细胞周期的影响双环铂干预HASMC生长48小时后以流式细胞仪检测细胞周期,试验重复4次,1μg/ml双环铂对HASMC作用48小时,G2/M期细胞百分比增加,细胞周期阻滞在G2/M期,10ng/ml-100ng/ml双环铂对HASMC作用48小时,S期细胞百分比增加,细胞周期阻滞于S期。阳性对照药物雷帕霉素对细胞周期的阻滞在Go/G1期。双环铂干预HAEC生长48小时后检测细胞周期,实验重复5次,在10μg/ml以上浓度时HAEC S期数目明显增加,双环铂对HAEC周期的阻滞处于S期。在10μg/ml以下浓度时双环铂对细胞周期的阻滞不显著。阳性对照药物雷帕霉素组,G0/G1期细胞数目增加,细胞周期阻滞在Go/G1期。在对HASMC和HAEC细胞周期检测中各药物组及正常对照组均未见凋亡峰(Sub-G1)。三、双环铂干预培养后HASMC和]HLAEC细胞增殖蛋白PCNA和凋亡蛋白Bax, Bcl-2表达的变化HASMC在不同浓度双环铂干预下,PCNA蛋白的表达量明显下降,其中双环铂100ng/mL组PCNA表达量达最低值。HAEC在不同浓度双环铂干预下,10μg/ml组和100ng/ml组PCNA表达量轻度减低,其他浓度组PCNA表达无明显变化。雷帕霉素在HASMC和HAEC中均抑制了PCNA的表达。在HASMC中,促凋亡蛋白Bax在各双环铂浓度组表达量均明显上升。抗凋亡蛋白Bcl-2表达在双环铂1μg/ml组升高,在100ng/ml组较正常组相比无明显差异,在10ng/ml、1ng/ml组Bcl-2表达稍减低,Bax/Bcl-2比值增高,即双环铂有促进凋亡作用。雷帕霉素组Bax/Bcl-2较正常对照组无明显变化。在HAEC中,Bax在各双环铂浓度组表达均升高,且随着药物浓度上升,Bax表达量有升高趋势。雷帕霉素组Bax表达较正常组降低。在同样的试验条件下,未检测到HAEC中Bcl-2蛋白表达。上述结果表明双环铂对HAEC也有促进凋亡的作用,低浓度的雷帕霉素无促凋亡作用。结论双环铂对HASMC和HAEC产生抑制增殖作用与药物作用时间、浓度呈正相关。随着药物作用时间的延长,药物浓度的增加,双环铂对细胞增殖的抑制作用逐渐加强。双环铂对HASMC的半数抑制浓度(IC50)为3.47μg/ml,对HAEC的半数抑制浓度为72.44μg/ml,两者相差20.88倍。双环铂对HAEC抑制增殖的最低有效浓度(10μg/ml)较对HASMC抑制增殖的最低有效浓度(10ng/ml)高1000倍。双环铂对HASMC和HAEC细胞周期的影响检测表明,双环铂为非特异性细胞周期阻滞药物。双环铂干预HASMC和HAEC后,HASMC表达PCNA显著下降,而HAEC表达PCNA正常或轻度下降,结果表明相同浓度下双环铂对HASMC的增殖抑制作用明显强于对HAEC的增殖抑制作用。双环铂干预HASMC和AEC后,促进HASMC凋亡蛋白的表达,表明双环铂在细胞凋亡的线粒体通路上,通过调节Bax和Bcl-2的表达,产生促进细胞凋亡的作用。但是这种促进凋亡的作用只体现在蛋白水平上,在细胞学实验中,流式细胞检测未见凋亡峰出现。综合上述实验结果,尽管在蛋白检测中发现细胞凋亡蛋白表达升高,但是细胞周期检测中在各个双环铂浓度组均未见凋亡峰,表明低浓度双环铂对细胞的抑制作用,主要是通过抑制细胞增殖来体现的。与雷帕霉素相比,双环铂抑制平滑肌作用尽管稍弱,但在纳克水平即可产生对平滑肌细胞的抑制作用；与雷帕霉素不同的是,双环铂对内皮细胞增殖的影响明显弱于对平滑肌细胞增殖的影响,在微克水平才产生对内皮细胞的抑制作用。双环铂这种对内皮细胞和平滑肌细胞抑制作用显著不同的特点,使其有希望成为药物洗脱支架的携带药物,值得进一步研究。