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研究背景:2型糖尿病给个体和社会带来了巨大的经济负担,老化和应激在2型糖尿病的发生中起着不可忽视的作用,探究其发病机制对于2型糖尿病的预防和治疗具有重要意义。目的:探讨老化与应激在胰岛细胞功能障碍发生中的作用及作用机制,以及枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharide,LBP)的保护作用。方法:1.老化与应激状态对丙酮酸脱氢酶复合体(PDC)的影响(1)分别利用Etoposide、连二亚硫酸钠和棕榈酸干预β-TC6细胞24h,建立衰老、缺氧及高脂模型,MTT法检测造模后细胞存活率,以确定最适衰老、缺氧及高脂造模浓度;(2)采用E1活性检测试剂盒测定造模后E1活性,明确老化与应激状态对丙酮酸脱氢酶复合体(PDC)的影响。2.PDC的状态对胰岛细胞功能的影响及作用机制(1)分别采用siRNA或慢病毒感染促使β-TC6细胞中E1基因沉默或过表达;(2)免疫荧光及Western Blot法观察干预后E1的分布及表达情况,检测沉默或表达的效果;(3)ELISA法检测干预后细胞核内乙酰辅酶A生成水平;(4)RT-PCR及Western Blot法检测干预后胰岛素基因增强结合蛋白1(Islet1)、胰岛素(Ins)、胰岛素促进因子-1(Pdx1)基因与蛋白表达水平。3.枸杞多糖(LBP)对PDC损伤引起的胰岛细胞功能障碍的保护机制(1)采用50μg/mL LBP与Etoposide、连二亚硫酸钠、葡萄糖和棕榈酸分别进行联合培养24h,E1活性检测试剂盒检测E1活性;Western Blot法检测LBP干预后β-TC6细胞中ISLET1、INS、PDX1和INSR蛋白的表达情况。结果:1.老化与应激状态对丙酮酸脱氢酶复合体(PDC)的影响(1)MTT实验发现,当Etoposide浓度为40μg/mL时,连二亚硫酸钠浓度为4mmol/L缺氧2h时,棕榈酸浓度为0.25mmol/L,造模最合适;(2)利用E1试剂盒检测各组细胞E1活性,结果显示造模后衰老组、缺氧组、高糖组(33.3mmol/L)和高脂组E1活性低明显低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。2.PDC的状态对胰岛细胞功能的影响及作用机制(1)基因沉默结果显示,采用E1a-722位点对E1进行沉默后细胞核内乙酰辅酶A的生成量明显降低;胰岛素分泌相关基因Islet1、Ins和Pdx1启动子区DNA的表达明显低于空白组和Scrambled siRNA组;细胞内ISLET1、INS、PDX1和INSR蛋白的相对表达水平也明显低于空白组和Scrambled siRNA组,差异均有统计学意义(P<0.05);(2)E1过表达后细胞内ISLET1、INS、PDX1和INSR蛋白的相对表达水平相比空白组和空载体对照组明显增高,差异均有统计学意义(P<0.05)。3.枸杞多糖(LBP)对PDC损伤引起的胰岛细胞功能障碍的保护机制(1)采用LBP干预后E1活性与蛋白相对表达水平相比衰老、缺氧与高脂模型组明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05);采用LBP干预后分别检测低糖、高糖以及糖浓度波动下后E1的活性与蛋白表达水平发现,从E1的活性来看,无论是在低糖、高糖还是糖波动下,LBP干预后单位蛋白浓度的E1活性较干预前无统计学差异(P>0.05)。但是从E1的蛋白表达水平来看,在单纯的低糖和高糖环境下加入LBP抑制E1的蛋白表达水平;在正常状态下或糖浓度波动时,加入LBP能够提高E1蛋白的表达水平。(2)对胰岛素分泌相关蛋白进行检测显示,LBP干预后ISLET1、INS、PDX1和INSR蛋白相对表达水平较衰老组、缺氧组和高脂组均明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05);高糖与糖波动状态下,LBP干预后PDX1表达均增加,而ISLET1和INSR蛋白的表达下降。表明LBP干预对老化与应激状态所致PDC损伤引起的胰岛素分泌障碍相关蛋白具有一定保护作用。结论:老化与应激状态会损伤PDC,进而抑制了核内乙酰辅酶A的生成,阻碍了组蛋白的乙酰化,抑制了Ins基因转录起始,同时对其相关的调节基因也产生了抑制,最终引起INS分泌障碍。LBP可能通过改善PDC损伤,增强胰岛素分泌相关蛋白的表达,促进胰岛素分泌,进而达到改善T2DM胰岛素分泌障碍的目的。