人偏肺病毒human metapneumovirus,简称hMPV,是荷兰学者Van den Hoogen等于2001年从患急性呼吸道感染的婴幼儿临床标本中首次分离鉴定出的一种新病毒,它与禽类肺病毒(APV)的C型有较高的同源性,已归属于副粘病毒科肺病毒亚科。其全基因组除了一部分终止序列未明外已克隆成功。hMPV基因组为负链RNA病毒,包括8个基因和9个开放阅读框架。基因组编码的主要结构蛋白有核蛋白(nucleoprotein,N)、基质蛋白(matrix protein,M)、融合蛋白(fusionprotein,F)、附着蛋白(attachment glycoprotein,G),其中F和G蛋白均为糖蛋白。另外还有磷蛋白P、22K蛋白M2和M2.2、小疏水蛋白SH、大多聚酶蛋白L。各蛋白基因组排列模式为3’-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5’。目前的研究认为hMPV可能是一种常见的呼吸道感染病毒,在呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒阴性的呼吸道感染标本中其检出率可达10%,在上或下呼吸道甚至上下呼吸道中均有检出,儿童和成人均有感染,尤其是早产儿、老人及有免疫缺陷的患者更易患hMPV感染。hMPV作为新发现的人类急性呼吸道感染的病毒已越来越受到人们的重视。当前hMPV的诊断只限于实验研究,由于用作病毒培养的常用细胞系不支持hMPV的复制,hMPV生长缓慢、病变不典型且其在体外复制需要依赖胰酶,故采用通常的临床病毒学方法很难鉴定hMPV。现在主要依赖于RT-PCR检测病毒的RNA对它进行研究。要对hMPV进行深入研究并弄清它在我国各年龄组人群中的感染状况急需病毒分离株或特异性抗原,但由于人类偏肺病毒不出现典型的细胞病变,在组织培养中分离十分困难,通过分子生物学手段获得特异性抗原用于研究就成为可行之路。本研究组已经获得了北京地区hMPV基因序列,在试图分离病毒株的同时,尝试运用不同的表达系统(细菌,酵母,昆虫)对人偏肺病毒重要的结构蛋白(N,F)进行了表达。之所以选择N和F蛋白,是因为N蛋白(nucleoprotein 1182bp,394aa)是核蛋白,氨基酸序列最保守,在不同的基因型别的病毒间差异最小。而F蛋白(fusion protein,1620bp,539aa)是一个糖蛋白,文献报道它是hMPV最主要的能引起中和保护性抗体的抗原。实施课题的第一阶段:为了便于蛋白纯化,在蛋白的N端加入了一个6His标签和相应的酶切位点,构建了重组pBh1887N(K)质粒(用于Bac-N-blu体系)和重组pFh1887N质粒(用于Bac-to-Bac体系),测序均正确。虽然昆虫Bac-N-blu体系中感染昆虫细胞所收获的上清进行蓝蚀班筛选,出现了蓝斑;昆虫Bac-to-Bac体系中感染昆虫细胞所收获的上清进行PCR鉴定有目的基因的插入都说明杆状病毒中有目的基因的插入,但是对感染72小时收获的昆虫细胞裂解液进行SDS-PAGE和Western blot(分别用His抗体和hMPV N蛋白特异性抗体检测),在SDS-PAGE上未观察到目的蛋白大小处有明显的大量蛋白表达,Western blot也没有检测到目的蛋白。实施课题的第二阶段:考虑是否该N端his标签阻碍了蛋白的表达。尝试变换标签的位置到蛋白的C端,并尝试在多体系中表达。构建了重组pB1887N质粒(用于Bac-N-blu体系),重组pF1887Nh质粒(用于Bac-to-Bac体系),单拷贝/双拷贝的pAOα1887Nh重组质粒(用于酵母表达系统),pET1887Nh重组质粒(用于细菌表达系统),测序均正确。前两个昆虫表达体系在收获了感染72小时后的昆虫细胞后,进行SDS-PAGE和Western blot(分别用His抗体和hMPV N蛋白特异性抗体检测)。在SDS-PAGE上未观察到目的蛋白大小处有明显的大量蛋白表达,Western blot可以检测到目的蛋白的表达。酵母表达系统无论单双拷贝,培养基上清虽然在SDS-PAGE上可见到43Kd处有蛋白出现,且不同克窿、菌株相对于对照载体菌表达的量不一样,但是进行Western blot使用his抗体和特异性抗体却没有检测出目的蛋白。通过PCR可以鉴定到酵母基因组中已同源重组入目的基因。细菌表达系统有较好的表达并能通过Western blot(分别用His抗体和hMPV N蛋白特异性抗体检测)鉴定目的蛋白表达。实施课题的第三阶段:在N蛋白尝试表达的基础上,构建了重组pB1816F质粒(用于Bac-N-blu体),重组pF1816Nh质粒(用于Bac-to-Bac体系),测序均正确。Bac-to-Bac体系所收获的感染72小时后的昆虫细胞裂解液,进行SDS-PAGE和Western blot(分别用His抗体和hMPV F蛋白特异性抗体检测)。在SDS-PAGE上未观察到目的蛋白大小处有明显的大量蛋白表达,Western blotHis抗体未检测到目的蛋白,而F蛋白特异性抗体检测在60kD可看到条带出现。Bac-N-blu体系所收获的感染72小时后的昆虫细胞培养液得到蓝蚀斑。实施课题的第四阶段:选择昆虫体系阳性重组病毒(N蛋白),扩大感染规模,his标签纯化N蛋白,进行临床血清学的调查鉴定,并同细菌表达的N蛋白测定结果进行比较,正在进行中。综合以上结果说明:偏肺病毒蛋白在不同的表达系统中表达难易不同,N蛋白在细菌表达系统中最易表达,但F蛋白表达受阻,可能跟其具有一定毒性,结构复杂有关;酵母体系有可能对N蛋白有修饰作用,使其无法被特异的短肽抗体所识别,F蛋白在构建表达载体时即受阻,无法同前导肽相连;昆虫杆状病毒系统对N,F蛋白均可以表达,但表达的量较低,有可能同初期重组病毒滴度低有关,而且昆虫细胞的状态好坏对蛋白表达影响较大,优化不易。在表达N蛋白时,构建了N端his标签和C端his标签的两种重组质粒,前者没有表达而后者顺利表达,测序结果均正确,无读码框的移位,提示his标签对N蛋白表达产生了阻扼作用,通过结构分析考虑应是在转录的mRNA起始处产生复杂的二级结构,影响了翻译的进行,需要在以后蛋白的表达中注意。通过研究各表达系统表达hMPV病毒蛋白,以期能够找到一种理想的表达体系,所表达的病毒蛋白可以用于接下来的血清学应用和病毒颗粒组装的研究。从而能够对hMPV本身,感染的临床症状和流行病学方面进行全面的研究,更好地认识hMPV感染与其所引发的疾病,找到有效的治疗措施。