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目的：构建Nrf2过表达及基因沉默的重组腺病毒，并且在A549细胞中进行表达构建NRF2过表达及基因沉默细胞模型，验证NRF2的调控以及表达效果。观察调控Nrf2基因对PQ暴露后A549细胞的炎症因子TNF-α、IL-6和氧化损伤指标CAT、SOD、MDA干预作用及对细胞内PQ蓄积浓度、膜转运蛋白P-gp、Octs、Mrps活性的影响。
方法：
1.在腺病毒基础上，引入Nrf2基因及shRNA序列，将重组腺病毒载体转染A549细胞，构建Nrf2过表达及基因沉默的细胞模型，通过绿色荧光蛋白验证腺病毒载体的转染效率，并以Western blot和Real-time PCR技术检测Nrf2的表达情况。
2.A549细胞百草枯暴露后，转染重组腺病毒载体AD-Nrf2shRNA、AD-Nrf2，AD-阴性对照序列，利用CCK-8，通过细胞生存率的比较，观察Nrf2基因对于百草枯暴露后细胞的保护作用。以ELISA检测NRF2表达对百草枯致A549细胞损伤后细胞上清中炎症因子IL-6、TNF-α蛋白氧化损伤指标CAT、SOD、MDA蛋白表达的影响。
3.以重组腺病毒载体Ad-Nrf2shRNA、Ad-Nrf2转染A549细胞，百草枯暴露后通过HPLC检测细胞内百草枯的含量，Western blot和Real-time PCR检测各组细胞中Nrf2及膜转运蛋白P gp、Octs、Mrps蛋白、基因的表达情况。
结果：
1.通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白，各转染腺病毒载体组转染效率均在90％以上;AD-Nrf2shRNA、AD-Nrf2腺病毒载体感染A549细胞后，通过Westernblot和Real-time PCR结果显示Nrf2在AD-Nrf2腺病毒载体感染A549细胞组中表达量明显升高，与其他组别有显著性差异。而在AD-Nrf2shrna转染组NRF2表达显著降低，与对照组差异明显。Nrf2过表达及沉默细胞模型构建成功。
2.AD-Nrf2、AD-Nrf2RNAI腺病毒载体转染能够分别明显提高与降低PQ暴露后A549细胞的存活率，干预细胞的百草枯抗性，且对IL-6、TNF-α、CAT、SOD、MDA蛋白表达亦产生作用。百草枯暴露后AD-Nrf2转染组相较于单纯暴露组IL-6、TNF-α、MDA蛋白水平组明显降低，SOD、CAT蛋白水平显著上升。AD-Nrf2shrna转染组TNF-α、CAT、SOD、MDA与对照组及单纯暴露组相比存在明显差异。
3.Nrf2在AD-Nrf2、AD-Nrf2shRNA腺病毒载体调控下，干预A549细胞内百草枯蓄积。与PQ暴露后转染阴性对照序列腺病毒载体相比，在暴露后转染AD-Nrf2组Oct3、Mrp1、Mrp2、Mrp3、Mrp4、MDR1 mRNA表达显著性增加，Oct1、Oct3、Mrp2、Mrp3、Mrp4、MDR1 mRNA AD-Nrf2shrna转染组明显下降。MRP1基因的表达在PQ暴露后转染阴性对照序列腺病毒载体与转染AD-Nrf2shrna组中没有明显差异。与PQ暴露后转染阴性对照序列腺病毒载体相比转染AD-Nrf2组OCT1基因的表达差异不明显。
结论：Nrf2过表达及基因沉默细胞模型构建成功，在细胞内上调以及抑制Nrf2的表达。重组腺病毒Ad-Nrf2对于百草枯暴露后的细胞保护作用明显，而过表达Nrf2基因上调Nrf2蛋白活性后所引起的A549细胞对PQ毒性的抗性明显增强，不但Nrf2与减轻细胞的氧化损伤、炎症水平有关，还与其增强细胞膜转运蛋白活性，减少细胞内PQ的蓄积有关。