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帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种多发于老年人的神经退行性疾病,其常见的运动症状有静止性震颤、运动迟缓、肌僵直、姿势反射障碍等,非运动症状有焦虑、睡眠障碍、认知障碍等。近年来,干细胞研究所取得的成就为PD治疗带来了新的希望。PD的主要病理特征为中脑黑质（substantia nigra,SN）多巴胺（dopamine,DA）能神经元的选择性缺失。PD的发病机制目前尚不清楚,但大量研究表明神经炎症在DA能神经元变性丢失过程中起着重要作用。研究表明神经干细胞（neural stem cells,NSCs）移植在改善PD神经炎症微环境中具有重要的作用。嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells,OECs）因其出色的神经营养功能经常被应用于细胞的联合移植中,被称为移植细胞的“营养泵”。近年来越来越多的证据表明OECs在改善移植细胞炎症微环境中起到重要作用。为研究NSCs与OECs联合移植对PD大鼠神经功能修复作用及其机制,本实验将E1112 d胎鼠中脑来源的NSCs进行体外培养、诱导分化和免疫荧光鉴定,将13d新生鼠嗅球来源的OECs体外培养并进行免疫荧光鉴定。移植前用GFP-HIV转染NSCs以标记NSCs,用Hoechst 33342标记OECs。在成年雄性Wistar大鼠右侧内侧前脑束和黑质两点注射6-羟多巴胺（6-hydroxydopamine,6-OHDA）制备PD模型,造模4 w后选择造模成功的PD大鼠进行纹状体（striatum,Str）内细胞移植。移植手术7 d后通过荧光观察细胞移植情况;通过旷场试验（open field test,OFT）、平衡木实验和握力测试检测PD大鼠的自发运动能力、焦虑程度、运动协调能力和肌僵直程度;通过蛋白质免疫印迹（western blot,WB）检测PD大鼠Str及SN脑区中酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）蛋白的表达变化和PD大鼠右侧Str脑区中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factorα,TNF-α）、白介素-1β（interleukin 1β,IL-1β）和白介素-4（interleukin 4,IL-4）蛋白的表达变化。结果如下:1.NSCs体外培养3代后可见形状规则的神经球,神经球经免疫荧光鉴定呈Nestin阳性,分化后的NSCs免疫荧光鉴定为TH阳性和GFAP阳性。体外培养的OECs呈现双极和多极的细胞形态,且大部分细胞免疫荧光鉴定呈P75NTR阳性。2.利用GFP-HIV转染NSCs标记NSCs,利用Hoechst 33342标记OECs,细胞绝大多数被成功标记。移植手术7 d后,对大鼠脑切片进行荧光观察,对照组和6-OHDA组均未观察到荧光,而各细胞移植组可见与细胞标记物相应的荧光,说明细胞移植成功。3.行为学实验结果显示,与对照组相比,6-OHDA组旷场运动距离较短（P<0.01,n=9-11）,说明6-OHDA组大鼠自发运动能力下降;相比6-OHDA组,联合移植组旷场运动距离较长（P<0.05,n=9-11）,但NSCs或OECs单独移植组旷场运动距离有所增加但无统计学差异,说明NSCs与OECs联合移植组大鼠自发运动能力短期内得到改善。相比对照组,6-OHDA组平衡木得分降低（P<0.001,n=9-11）,说明6-OHDA组大鼠运动协调能力下降;相比6-OHDA组,单独移植组或联合移植组的平衡木得分均略有上升,但差异无统计学意义（P>0.05）,说明单独移植组或联合移植组大鼠运动协调能力短期内无改善。相比对照组,6-OHDA组悬挂持续时间增加,说明6-OHDA组大鼠肌僵直程度增加（P<0.05,n=9-11）;相比6-OHDA组,单独移植组或联合移植组悬挂持续时间均略有下降,但差异无统计学意义（P>0.05）,说明单独移植组或联合移植组大鼠肌僵直症状短期内无明显缓解。4.OFT结果显示,与对照组相比,6-OHDA组的旷场外周与中央活动时间比值（Pt/Ct）变大,说明6-OHDA组大鼠焦虑程度较高（P<0.05,n=9-11）,与6-OHDA组相比,OECs移植组和联合移植组的Pt/Ct变小,说明OECs移植组和NSCs与OECs联合移植组的焦虑程度较低（P<0.05,n=9-11）。5.PD大鼠左侧Str和SN的TH蛋白表达均无变化（P>0.05）。右侧Str的TH蛋白表达变化明显,与对照组相比,6-OHDA组、NSCs移植组、OECs移植组和联合移植组的TH表达量均减少（P<0.001,n=5-7）,而与6-OHDA组相比,NSCs移植组和联合移植组的TH表达量略有增加,但无统计学意义（P>0.05）;右侧SN的TH表达变化明显,与对照组相比,其余四组TH表达量均减少（P<0.001,n=5-7）,与6-OHDA组相比,联合移植组的TH表达量略有增加,但无统计学意义（P>0.05）。6.PD大鼠右侧Str的炎性因子表达变化明显。与对照组相比,6-OHDA组的TNF-α、IL-1β和IL-4表达量均增加（P<0.05,n=5-7）。与6-OHDA组相比,联合移植组的TNF-α和IL-1β表达量减少（P<0.05,n=5-7）,IL-4的表达量略有增加,但无统计学差异（P>0.05）;单独移植组的IL-1β表达量减少（P<0.05,n=5-7）,且TNF-α与IL-4表达量减少,但均无统计学差异（P>0.05,n=5-7）。以上结果表明,NSCs和OECs联合移植7d后PD大鼠的自发运动能力增强,焦虑程度降低;促炎因子TNF-α和IL-1β的表达量减少,说明联合移植短期内能促进PD大鼠神经功能部分修复,其修复机制可能与促炎因子的表达量减少有关。本研究结果将为今后应用NSCs和OECs联合移植治疗PD供新的实验和理论依据。