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研究背景:随着多组学研究技术的兴起与发展,基因组学,蛋白质组学和代谢组学被广泛应用于中医证候的物质基础、分类及标准化等领域的研究。证候是机体在疾病发展过程中的某一阶段的病理概括,涵盖了病位、病因、病性,及邪正关系,反映出疾病在发展过程中的某一阶段的病理变化,因而它比症状更为全面和综合地揭示了疾病的生物学基础,是中医认识疾病和辨证论治的主要依据。现代医学中的表型是指基因型与环境(即影响基因的外界因子)相互作用后,表现出来的性状、特征的总和,表现为多基因复杂性和动态演变的过程,与中医学中以证候概括发病过程有显著的相似之处。因此,证候作为一组复杂表型,被纳入本研究。目前多组学技术与证候的相关研究方法多以定性或半定量研究为主,定量研究较少。例如,通过基因组学技术判断证候与生物遗传标志物之间的半定量关系。基因组与证候的定量关系仍不明确。因此,利用基因型-表型的定量分析方法,将中医证候作为一组特定的表型,从全基因组层面上来探究影响特定证的分子遗传基础。本研究以丹红注射液慢性稳定性心绞痛血瘀证数据为例,通过定量关联方法,探究药物干预下证候与基因的定量关联以及药物作用的分子机制。研究目的:运用定量关联分析方法分析丹红注射液治疗下慢性稳定性心绞痛血瘀证表型变化及其与mRNA分子的关联,探索丹红注射液干预下慢性稳定性心绞痛血瘀证证候动态变化的分子机制以及丹红注射液治疗慢性稳定性心绞痛血瘀证可能的生物标志物,为证候的诊疗提供新的思路和方法。研究方法:采用斯皮尔曼(spearman)关联方法计算丹红注射液干预前后(0天,14天,30天)的慢性稳定性心绞痛血瘀证患者的基因表达水平与症状的相关性,筛选出血瘀证症状相关基因,筛选条件为相关系数绝对值大于0.4且P值小于0.05。使用Metascape(https://metascape.org/)对血瘀证中的六个症状在丹红注射液不同干预时点下的相关基因进行功能富集分析,比较血瘀证中的六个症状在不同用药条件下相关基因的通路和功能,探究丹红注射液治疗慢性稳定性心绞痛血瘀证症状动态变化的分子机制。采用WGCNA方法分别建立0天,14天,30天的基因共表达网络,并分别与对照组和治疗组基线比较,确定与丹红注射液治疗14天和治疗30天相关的靶点模块,用典型相关分析分别计算靶点模块与两个时间点血瘀证证候的相关系数,分别找出两个时间点与慢性稳定性心绞痛血瘀证相关的靶点模块,筛选条件为相关系数绝对值大于0.5。分别对两个时间点血瘀证靶点模块进行功能富集分析,比较血瘀证中不同用药条件下靶点模块的通路和功能,探究丹红注射液治疗慢性稳定性心绞痛血瘀证证候动态变化的分子机制。对两个时间点中血瘀证靶点模块的相关性大于0.8的模块基因进行网络拓扑度中心性分析和血瘀证CCA相关系数计算,经归一化后,确定度中心性和CCA相关系数均>0.75的基因为丹红注射液治疗慢性稳定性心绞痛血瘀证的潜在靶点基因。研究结果:1、采用spearman关联分析获得第0天、14天、30天与慢性稳定性心绞痛血瘀证症状相关的基因。胸痛相关基因个数:0天77个,14天60个,30天1726个。胸闷相关基因个数:0天34个,14天192个,30天82个。心悸不宁相关基因个数:0天155个,14天47个,30天341个。唇色紫暗相关基因个数:0天1617个,14天1112个,30天757个。舌暗相关基因个数:0天333个,14天220个,30天1115个。脉细涩相关基因个数:0天1007个,14天812个,30天684个。2、血瘀证症状相关基因功能富集分析结果显示:(1)胸痛第0天相关基因富集出GO功能97个,KEGG通路5条,主要与转运和代谢相关;第14天相关基因富集出GO功能41个,未富集出KEGG通路,主要与转运和细胞结构与生物合成相关;第30天相关基因富集出GO功能1482个,KEGG通路66条,主要与信号转导、代谢和免疫相关。(2)胸闷第0天相关基因富集出GO功能2个,未富集出KEGG通路,主要与细胞和细胞结构与生物合成相关;第14天相关基因富集出GO功能230个,KEGG通路16条,主要与免疫、代谢和转运相关;第30天相关基因富集出GO功能60个,KEGG通路2条,主要与细胞周期和细胞结构与生物合成相关。(3)心悸不宁第0天相关基因富集出GO功能156个,KEGG通路9条,主要与代谢、细胞通讯相关;第14天相关基因富集出GO功能2个,未富集出KEGG通路,主要与信号转导相关;第30天相关基因富集出GO功能139个,KEGG通路19条,主要与神经系统、内分泌系统和代谢相关。(4)唇色紫暗第0天相关基因富集出GO功能909个,KEGG通路73条,主要与信号转导、免疫和代谢相关;第14天相关基因富集出GO功能424个,KEGG通路18条,主要与代谢相关;第30天相关基因富集出GO功能265个,KEGG通路15条,主要与代谢相关。(5)舌暗第0天相关基因富集出GO功能249个,KEGG通路9条,主要与癌症、神经系统和发育相关;第14天相关基因富集出GO功能149个,KEGG通路5条,主要与心血管疾病、代谢相关;第30天相关基因富集出GO功能542个,KEGG通路25条,主要与遗传信息处理和代谢相关。(6)脉细涩第0天相关基因富集出GO功能471个,KEGG通路53条,主要与信号转导、癌症、免疫和代谢相关;第14天相关基因富集出GO功能230个,KEGG通路14条,主要与代谢相关;第30天相关基因富集出GO功能191个,KEGG通路3条,主要与代谢和发育相关。3、基于KEGG通路和GO功能分析对丹红注射液干预下血瘀证各症状之间的联系,发现“唇色紫暗”、“舌暗”、“脉细涩”之间具有较高的关联性,尤其是“唇色紫暗”和“脉细涩”分别在第14天拥有共同的基因299个、GO功能52个、KEGG通路1条,第30天拥有共同的基因100个、GO功能15个,主要与核苷酸代谢、运输等相关。两个主要症状,“胸痛”和“胸闷”,两者在第14天无共有的基因和通路,仅有3个功能相同,而第30天时,两者具有共同的基因35个,GO功能19个;其中与“胸痛”症状相比,在第14天时,“胸闷”症状与上述3个体征具有更多共同的基因、通路和功能,与代谢、细胞分化、信号转导等有关;然而到第30天时,变为“胸痛”症状与体征具有更多的共同基因、通路和功能,与转运、代谢、信号转导和细胞结构与生物合成相关。4、与丹红组0天比较,丹红组第14天基因共表达网络被划分为99个模块,差异模块75个。与对照组第14天比较,丹红组第14天基因共表达网络基因被划分为90个模块,差异模块70个,综合两个比较结果获得丹红组第14天靶点模块5个。与丹红组0天比较,丹红组第30天基因共表达网络被划分为122个模块,差异模块101个。与对照组第30天比较,丹红组第30天基因共表达网络基因被划分为126个模块,差异模块87个。综合两个比较结果获得丹红组第30天靶点模块5个。通过CCA分析获得丹红注射液治疗血瘀证相关靶点模块共7个。5、分别对两个时间点与血瘀证相关的靶点模块进行功能富集分析。第14天的3个血瘀证相关靶点模块中有2个模块富集出6个GO功能和1条KEGG通路(RAS信号通路),第30天的4个血瘀证相关靶点模块中有2个模块富集出12个GO功能。对GO功能进行分类后,第14天与结合、细胞增殖、钙离子结合、酶调节活性相关;第30天与转运活性、细胞结构与生物合成、细胞分化和细胞增殖等相关。6、对相关系数>0.8的血瘀证相关靶点模块中基因,其归一化后度中心性和CCA相关系数均>0.75的基因为:MIR1183、LOC643355和SKINTL。结论:1、慢性稳定性心绞痛血瘀证症状在药物未干预前,其主要分子机制与癌症、代谢、信号转导和免疫等功能相关,丹红注射液干预到第14天时,主要与免疫、代谢、信号传导和遗传信息处理相关功能,治疗到第30天时转变为与代谢和信号转导相关功能。2、丹红注射液干预下,第14天时血瘀证的“胸闷”、“唇色紫暗”、“舌暗”与“脉细涩”间关联密切,主要与一些代谢、信号转导和细胞分化相关;到第30天时“胸痛”与体征关联密切,相关功能涉及到转运、代谢、信号转导等。3、丹红注射液治疗慢性稳定性心绞痛血瘀证证候时,其主要作用机制与细胞增殖相关。此外,在第14天时还与RAS信号通路、钙离子结合、酶调节活性相关;在第30天时可能变为与转运、细胞结构与生物合成、细胞分化等相关。4、丹红注射液治疗慢性稳定性心绞痛潜在靶点基因为MIR1183、LOC643355和SKINTL。