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背景黑色素瘤作为一种皮肤恶性肿瘤,严重危害人类健康。Pimozide(匹莫齐特)作为一种很早就被用于治疗转移性黑色素瘤患者的药物,并未取得令人满意的效果。随着肿瘤免疫治疗的发展,免疫治疗联合化学疗法受到了人们更多的关注。程序性死亡受体1(Programmed cell death protein 1,PD-1),是一种重要的免疫抑制分子,我们前期设计了三条具有干扰效果的PD-1-siRNA序列,本研究将探索PD-1-siRNA联合Pimozide两者是否协同增强抗黑色素荷瘤小鼠的治疗效果,并且初步探索其机制。目的探讨减毒沙门氏菌运载PD-1-siRNA增强Pimozide抗黑色素瘤治疗的作用及机制。方法1.细胞实验EL-4(小鼠淋巴瘤细胞)铺制细胞板,验证PD-1-siRNA的功能;铺制B16(小鼠黑色素瘤细胞)细胞板,14h-16h后加入不同浓度的Pimozide药物,分别在24h、48h流式检测细胞凋亡情况;另外72h时通过Transwell实验检测细胞在不同浓度的Pimozide作用下B16细胞的侵袭能力。2.动物实验购买周龄为6周左右大的雄性C57BL/6小鼠随机分为5组,分别为PBS组、Scramble组、Pimozide组、pSi-PD-1组、Pimozide联合pSi-PD-1组,建造黑色素瘤荷瘤小鼠模型一周之后进行各组治疗。观察C57BL/6小鼠肿瘤的发生率,测量肿瘤的重量以及记录黑色素瘤小鼠的生存期;通过western blot的方法检测肿瘤组织中CD4,CD8,Casepase-3,PD-1等相关蛋白的表达变化;通过免疫组织化学的方法检测小鼠肿瘤组织中免疫细胞的浸润情况,TUNEL凋亡荧光检测黑色素荷瘤小鼠肿瘤组织中凋亡细胞的表达水平;通过FACS方法检测小鼠脾脏中CD4~+T细胞和CD8~+T细胞、PD-1~+免疫细胞的比例,以及检测NK1.1~+免疫细胞和CD25~+Foxp3~+调节T细胞(Treg)的比例。结果1.Pimozide能够抑制B16细胞的侵袭能力,增加B16细胞的凋亡。2.我们自主设计的PD-1-siRNA能够有效地干扰EL-4细胞上PD-1的表达。3.黑色素瘤荷瘤小鼠体内实验,通过减毒沙门氏菌运载PD-1-siRNA联合Pimozide治疗,可以延长小鼠生存期,抑制肿瘤生长,两者具有协同抗肿瘤治疗的效果。4.黑色素瘤荷瘤小鼠体内实验,减毒沙门氏菌运载PD-1-siRNA联合Pimozide治疗,可以显著地抑制了肿瘤微环境中T细胞表面PD-1的表达,并诱导肿瘤细胞凋亡。并且增加了黑色素瘤荷瘤小鼠肿瘤组织中T淋巴细胞浸润,抑制PD-1的表达。5.减毒沙门氏菌运载PD-1-siRNA联合Pimozide治疗黑色素荷瘤小鼠,增加了黑色素瘤荷瘤小鼠脾脏中的CD4~+T细胞和CD8~+T细胞以及NK1.1~+免疫细胞的比例,降低PD-1~+免疫细胞和CD25~+Foxp3~+Treg的比例。结论Pimozide可以有效地抑制B16细胞的侵袭能力,增加其凋亡,减毒沙门氏菌运载PD-1-siRNA联合Pimozide治疗能够有效的抑制黑色素荷瘤小鼠的肿瘤生长,延长其生存期,两者具有协同抗黑色素荷瘤小鼠的治疗效果,并且并未出现明显的毒副反应。因此,减毒沙门氏菌运载PD-1-siRNA联合Pimozide治疗有可能成为治疗黑色素瘤的一种潜在的新治疗策略。