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过敏性哮喘是以气道高反应性(airway hypersensitivity, AHR).嗜酸性粒细胞和Th2细胞过度浸润以及血清高水平IgE为特征的慢性气道变应性炎症性疾病。目前研究认为,T淋巴细胞优势性分泌IL-4、IL-5、IL-13等Th2类细胞因子在过敏性哮喘的引发中扮演着重要角色。Cd3001f(CD300 antigen like family member F)分子是一个氨基端带有信号肽、胞外段带有IgV样结构域、跨膜区、胞内段带有免疫受体酪氨酸抑制基序(immune-receptor tyrosine-based inhibitory motifs, ITIM)和免疫受体酪氨酸转化基序(immune-receptor tyrosine-based switching motif, ITSM)的Ⅰ型糖蛋白。有研究显示,阻断或沉默树突状细胞表面Cd3001f分子的表达能够促进树突状细胞启动的T细胞增殖以及抗原特异性T细胞应答,表明Cd3001f分子具有负向调控树突状细胞启动T细胞应答的功能。在本研究中,我们根据GenBank提供的小鼠Cd3001f基因核酸序列(NM 145634.3),设计含完整开放阅读框(open reading frame, ORF)的Cd3001f基因特异性引物,采用反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)从小鼠骨髓来源树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells, BMDCs)中扩增得到Cd3001f基因,将其与pMD-18T载体连接构建重组质粒pMD-Cd3001fo经生物信息学分后,设计特异性引物以重组质粒pMD-Cd3001f.为模板聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增Cd3001f基因编码区不含信号肽的胞外段,将其与pGEX-4T-3载体连接构建原核表达质粒pGEX-Cd3001f (22 aa-185aa).原核表达质粒载体转化大肠杆菌Rosetta (E3)后,经IPTG诱导表达了约45.5kD的GST-Cd3001f (22aa-185aa)融合蛋白。表达产物经GSTrap FF亲和层析柱纯化后皮下免疫接种新西兰大白兔,制备了抗GST-Cd3001f (22 aa-185aa)融合蛋白多克隆抗体。酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)结果显示,其抗体效价高达1：16384。将Cd3001f基因真核表达质粒转染人胚胎肾细胞(human embryonic kidney 293 cells, HEK293),间接免疫荧光实验(indirect immunofluorescence assays, UFA)和免疫印迹实验(Western blot)检测兔抗GST-Cd3001f (22-185aa)融合蛋白多克隆抗体的特异性。结果显示,该多克隆抗体能够特异性的识别Cd3001f真核表达蛋白。根据siRNA设计原则,设计5对小鼠Cd3001f基因保守序列编码短发卡KNA (short hairpin RNA, shRNA)的正义、反义寡核苷酸链,将其退火后分别克隆至pLL3.7质粒载体中获得Cd3001f基因shRNA表达质粒。采用脂质体法,分别将Cd3001f基因shRNA表达质粒与Cd3001f基因真核表达质粒PCDNA-Cd3001f共转染HEK293细胞48小时。Real-time PCR分析显示,重组质粒pLL-Cd3001f-shRNAe对Cd3001f基因mRNA抑制率为75.6%。以重组质粒pMD18-Cd3001f为模板PCR扩增Cd3001f基因,将其插入穿梭质粒pAdTrack-CMV中。以重组质粒PLL-Cd3001f-shRNAe为模板PCR扩增含U6启动子的Cd3001f基因shRNA,将其插入穿梭质粒pAdTrack中。Pme I酶切阳性重组质粒后转化含重组腺病毒骨架质粒Adeasy-1的感受态菌BJ5183,进行同源重组。PacⅠ酶切重组腺病毒载体后,脂质体法转染HEK293细胞。转染后12-18天,获得重组腺病毒Ad-Cd3001f、Ad-Cd3001f-shRNA。大量扩增重组腺病毒,并采用CsCl密度梯度离心法进行纯化。重组腺病毒Ad-Cd3001f滴度为1.4×109PFU/ml, Ad-Cd3001f-shRNA滴度为2.6×109PFU/mL以感染复数(a multiplicity of infection, MOI)为75的重组腺病毒感染BMDCs48小时。Real-time PCR分析显示,Ad-Cd3001f感染细胞中Cd3001f基因mRNA的表达水平显著升高,而Ad-Cd3001f-shRNA感染细胞中Cd3001f基因nRNA表达水平下降达51.7%。Westernblot分析显示,Ad-Cd3001f感染细胞特异性地表达了Cd3001f蛋白。分别于第0天、第14天给C57BL/6小鼠腹腔注射经凝胶佐剂乳化的卵清白蛋白(ovalbumin, OVA),第二次致敏后10天OVA溶液连续激发3天。以MOI为75的重组腺病毒Ad-Cd3001f (DC-Cd3001f)和Ad-Cd3001f-shRNA (DC-siCd3001f)分别感染培养5天的BMDCs24小时,再用OVA激发24小时。分别于OVA首次致敏前7天和致敏后3天小鼠腹腔注射DC-Cd3001f或DC-siCd3001f。最后一次激发后24小时,检测气道高反应性。吉姆萨瑞氏染色行肺泡灌洗液炎性细胞分类计数。H&E和PAS染色观察肺组织病理学变化。EL1SA检测支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF).脾细胞培养上清中IL-4、IL-5、IL-13和IFN-y的含量。流式细胞术检测脾细胞中CD4+Foxp3+ Tregs和CD4+IL-17A+ Th17的百分比。研究结果显示,DC-siCd3001f免疫哮喘小鼠后能够减轻气道高反应性和肺组织炎症,降低肺泡灌洗液和脾细胞培养上清中IL-4、IL-5和IL-13的分泌,提高脾细胞中CD4+Foxp3+Tregs的百分比,降低脾细胞中CD4+IL-17A+Th17的百分比。综上所述,过继性回输DC-siCd3001f能够显著降低哮喘小鼠的气道高反应性,抑制气道炎症,减少Th2类细胞因子的分泌以及引发脾脏中高比例的CD4+FoxP3+ Tregs和低比例的CD4+IL-17A+Th17,为哮喘的治疗提供了新思路。