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传统的甜味剂蔗糖等具有高热量和致高血糖等缺点,过多的摄入会导致糖尿病、肥胖和心血管疾病等慢性病的发生,因此开发新型的低热量功能性甜味剂已经成为国际食品科学的研究热点。近几年发现的D-阿洛酮糖是一种新型的功能性甜味剂。作为稀少糖的一种,D-阿洛酮糖的甜度是蔗糖的70%左右,而其能量值不到蔗糖的10%。此外,D-阿洛酮糖还具有优秀的生理功能,如防龋齿、降低血糖水平、预防和改善糖尿病以及抑制体内脂肪的累积。D-阿洛酮糖已被美国食品药品管理局(FDA)认证为一般认为安全(GRAS),并可作为膳食补充剂应用于食品、医药等领域。生物酶法是合成D-阿洛酮糖最主要的方法,在D-阿洛酮糖3-差向异构酶的催化作用下,D-果糖异构化生成D-阿洛酮糖。目前,基因工程菌的不安全性以及抗生素耐药性已上升到全球化问题,选用安全宿主以及构建无抗生素抗性基因的工程菌株是未来研究的发展方向。本研究以来源于Clostridium scindens ATCC 35704的D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPEase)基因为研究对象,构建不含抗生素抗性基因表达DPEase酶的重组枯草芽孢杆菌,为生产食品级D-阿洛酮糖奠定应用基础。主要研究内容和结果如下:(1)利用Cre/lox特异性重组系统与重叠延伸PCR相结合的方法,成功构建了D-丙氨酸缺陷型的枯草芽孢杆菌1A751(dal-),这种突变菌株无法在不添加D-丙氨酸的培养基中生长。利用“simple cloning”方法,在枯草芽孢杆菌中构建单启动子重组质粒p UB-dpe-dal以及双启动子重组质粒p UB-P43dpe-dal,同时利用D-丙氨酸消旋酶基因(dal)代替质粒中原有的抗生素抗性基因作为筛选标记。将重组质粒导入枯草芽孢杆菌1A751(dal-)中,可复制质粒上的dal基因可互补枯草芽孢杆菌1A751(dal-)染色体上dal基因的缺失,从而起到筛选和维持质粒复制的作用。具有双启动子的重组枯草芽孢杆菌1A751/p UB-P43dpe-dal的发酵酶活约为6 U/m L,高于单启动子的重组枯草芽孢杆菌1A751/p UB-dpe-dal的酶活(4.5 U/m L)。收集重组菌1A751/p UB-P43dpe-dal发酵后的菌体,经真空冷冻干燥后,作为酶粉,用于转化D-果糖生成D-阿洛酮糖。最佳转化条件为750 g/L的D-果糖溶液,添加2 g/L的冻干酶粉,反应1 h可生成178 g/L的D-阿洛酮糖。(2)利用重叠延伸PCR的方法,将枯草芽孢杆菌内源启动子P43与dpe基因融合。通过双交换整合的方式,将P43-dpe表达片段与lox71-spc-lox66抗性基因表达盒一同插入至枯草芽孢杆菌1A751染色体中的淀粉酶基因位点,再利用Cre/lox特异性重组系统将染色体中的抗生素抗性基因spc敲除,最终得到无抗生素抗性基因染色体整合表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌1A751/P43-dpe,且重组菌的遗传稳定性较好。在P43-dpe表达片段的两端引入同尾酶位点,利用同尾酶法成功构建并筛选得到n个拷贝数(包括1,2和3拷贝数)的重组整合质粒p DG-ndpe(n=1,2,3),通过双交换染色体整合的方式,分别将1,2和3拷贝数的P43-dpe表达盒成功插入至枯草芽孢杆菌1A751染色体上,并利用Cre/lox系统将抗生素抗性基因敲除,得到不含抗生素抗性基因的1,2或3拷贝串联P43-dpe基因的重组枯草芽孢杆菌1A751-n DPE(n=1,2,3)。重组枯草芽孢杆菌1A751-3DPE的发酵酶活约为0.75 U/m L,是重组菌1A751-1DPE发酵酶活的2.2倍。实验结果表明,增加dpe基因的拷贝数可以在一定程度上增加其表达量,从而提高DPEase酶活。通过对比四种常见的培养基发现,重组枯草芽孢杆菌1A751-3DPE在SOC培养基中的发酵酶活以及总酶活最高,分别为80 U/g菌体和2000U/L发酵液。重组菌1A751-3DPE全细胞催化D-果糖异构化生成D-阿洛酮糖的最佳条件为300 g/L的D-果糖,添加8 g/L的冻干酶粉,1 h可转化生成60 g/L的D-阿洛酮糖,转化率约为20%。(3)将目的基因dpe与芽孢衣壳蛋白编码基因Cot Z相融合,融合基因Cot Z-CL-dpe通过双交换染色体整合的方式,以trp C基因作为筛选标记,成功整合至枯草芽孢杆菌WB800染色体上,得到不含抗生素抗性基因的重组枯草芽孢杆菌WB800/Cot Z-CL-dpe。此外,DPEase酶通过α-螺旋连接肽与枯草芽孢杆菌衣壳蛋白Cot Z的C端相连接,以辅助DPEase蛋白酶的折叠,稳定其结构。利用饥饿法在DSM培养基中诱导重组菌WB800/Cot Z-CL-dpe产生孢子,重组孢子经过外加蛋白酶处理后,DPEase酶活明显下降,说明DPEase酶成功展示在枯草芽孢杆菌孢子的表面。研究重组孢子表面展示DPEase的酶学性质发现,孢子表面展示DPEase酶的最适温度为55°C,最适p H范围为7.5~8.0。60°C条件下的重组孢子表面展示DPEase酶的半衰期为170 min,具有较好的耐热稳定性。重组孢子转化D-果糖生成D-阿洛酮糖的最佳条件为:温度55°C,500 g/L的D-果糖溶液,添加30 g/L的重组孢子。此条件下D-阿洛酮糖的产率为7.1 g/L/h。反应12 h后,D-果糖的转化率为17%。重组孢子循环使用5次后,重组孢子的DPEase酶活基本保持不变,而D-阿洛酮糖的产量下降至最初的60%左右,具有良好的重复利用性。