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龋齿是一种由细菌感染引起的疾病,严重危害人们的口腔健康。致龋菌通过粘附聚集在牙齿表面,形成牙菌斑,再利用蔗糖产酸,造成牙齿脱矿,导致龋齿的发生。若能抑制致龋菌的粘附聚集,就能从根本上防止龋齿的发生。原花青素是一种从植物中分离得到的天然活性多酚,在天然抗龋齿功效成分的研究中越来越受到关注,但原花青素对S.sobrinus致龋作用的抑制效果和抑制机理尚不清楚。本文从高粱外种皮中分离得到3种B型原花青素低聚体(sorghum episperm procyanidin,SEP),以S.sobrinus ATCC 6715为对象,比较SEP对S.sobrinus ATCC 6715生长的抑制和初始粘附的干预效果,筛选出高抗龋活性的SEP。在此基础上,通过基因克隆重组表达的方法得到S.sobrinus ATCC 6715的GTF-I的CAT区蛋白,并通过光谱法研究SEPⅣ与GTF-I的CAT区蛋白的相互作用,探讨SEPⅣ对GTF-I活性的抑制机理,期望为揭示SEPⅣ抗龋齿的作用机制提供依据。本文研究内容和研究结果如下:1.高粱外种皮中B型低聚体的提取分离和鉴定:采用70%的乙醇提取SEP,通过AB-8大孔树脂纯化得到原花青素混合物,并用乙酸乙酯萃取得到原花青素低聚体,再通过Toyopearl HW-40s凝胶色谱分离得到三组目标级分,经过RP-HPLC-ESI-MS/MS鉴定,三组级分对应的分子离子m/z分别为577、865和1153,分别为B型原花青素二聚体、三聚体和四聚体,将三组级分分别命名为SEPⅡ、SEPⅢ和SEPⅣ。2.SEPⅡ、SEPⅢ和SEPⅣ对S.sobrinus ATCC 6715生长和初始粘附的影响:通过二倍稀释法研究SEPⅡ、SEPⅢ和SEPⅣ对S.sobrinus ATCC 6715的MIC值分别为16.00 mg/m L、16.00 mg/m L和8.00 mg/m L,证明SEPⅡ、SEPⅢ和SEPⅣ都可以抑制S.sobrinus ATCC 6715的生长。采用唾液包被的羟基磷灰石(saliva coated hydroxylapatite,SHA)体外模型模拟牙齿表面,用SEPⅡ、SEPⅢ和SEPⅣ分别处理唾液、唾液获得性膜和S.sobrinus ATCC 6715菌体三种途径干预S.sobrinus ATCC6715在SHA上的初始粘附过程,SEPⅡ、SEPⅢ和SEPⅣ处理唾液干预S.sobrinus ATCC 6715在SHA的粘附抑制率分别为10%-42%、30%-42%和20%-45%;SEPⅡ、sepⅢ和sepⅣ处理唾液获得性膜干预s.sobrinusatcc6715在sha的粘附抑制率分别为7%-35%、10%-47%和20%-54%;sepⅡ、sepⅢ和sepⅣ处理s.sobrinusatcc6715菌体表面干预其在sha的粘附抑制率分别为33%-63%、42%-66%和50%-75%,结果表明,sepⅡ、sepⅢ和sepⅣ都可以抑制s.sobrinusatcc6715在sha上的初始粘附,抑制效果都随着浓度的增大而增大,具有一定的浓度效应关系;且对初始粘附抑制效果的强弱顺序是:sepⅣ>sepⅢ>sepⅡ,sepⅣ是具有高抗龋活性的物质。在处理唾液、唾液获得性膜和s.sobrinusatcc6715菌体3种干预途径中,作用于菌比作用于唾液和唾液获得性膜的抑制效果更好,说明sep对菌的抑制是干预s.sobrinusatcc6715在牙齿表面初始粘附的主要途径。3.s.sobrinusatcc6715中gtf-i的cat区蛋白的克隆、表达和鉴定:为了进一步研究sepⅣ对促进s.sobrinusatcc6715粘附聚集的gtf-i的抑制效果和作用机制,通过基因工程重组表达的方法获得s.sobrinusatcc6715中gtf-i的cat区蛋白。通过pcr扩增cat的基因片段到质粒pgex-4t-1中,转化至大肠杆菌t7expresscompetente.coli(highefficiency)表达,1mmol/liptg,37℃诱导4h,纯化、浓缩得到目标蛋白gtf-i/cat,纯度为85%,表达量为1.22mg/ml,nanolc-ms/ms鉴定结果表明gtf-i/cat蛋白是来源于s.sobrinusatcc6715(血清型g)的gtf-i,得分为103.75,鉴定结果可信;neson-somogyi法测得其酶活为8.446miu,蒽酮硫酸法测得其产多糖能力为1.603mg/(mg·h)。4.sepⅣ与gtf-i/cat相互作用的研究:用不同浓度sepⅣ处理gtf-i/cat,根据wic生成量评价sepⅣ对gtf-i/cat活力的影响,sep-Ⅳ可以抑制gtf-i/cat产wig,抑制效果随着sep-Ⅳ浓度的增大而增大,当sep-Ⅳ的浓度大于125μg/ml,能使wig产量显著性降低(p<0.01)。通过紫外-可见吸收光谱、荧光淬灭光谱和同步荧光光谱研究sepⅣ与gtf-i/cat的相互作用,荧光光谱分析结果表明,sep-Ⅳ可以对gtf-i/cat产生荧光淬灭,stem-volmer方程分析淬灭机制是静态淬灭;两者发生结合的结合位点数为0.7682(289k)、0.7924(299k)和0.8617(309k),约等于1;热力学参数△g<0、△s>0、△h>0,说明sep-Ⅳ和gtf-i/cat之间主要是通过疏水作用力结合;同步荧光表明,sep-Ⅳ与gtf-i/cat的结合位点更靠近色氨酸残基。sep-Ⅳ可以使gtf-i/cat的紫外-可见吸收光谱的吸收峰的吸光值增加并发生红移,说明SEP-Ⅳ可以对GTF-I/CAT蛋白构象产生影响,并进一步证明SEP-Ⅳ和GTF-I/CAT之间是静态淬灭。结果表明,SEPⅣ与GTF-I的CAT的相互作用,可以改变CAT的构象,对酶的功能和活性产生影响,导致WIG产量降低,从而减少致龋菌在牙齿表面的粘附聚集,预防龋齿的发生。