目的:胃癌是在进化过程中累积了多种遗传和表观遗传改变而发生的高度异质性恶性肿瘤,不同患者的肿瘤生物学特征差别很大。现有的组织病理学分型因难以全面客观反映肿瘤的内在特征,而无法满足精准医疗时代下的胃癌个体化治疗需求。随着高通量基因芯片和新一代测序技术的进步,胃癌分子分型逐渐成熟,对分子分型的理解和应用成为实现胃癌精准治疗的基础和必要条件。2014年TCGA项目提出了胃癌的四种分子分型,包括EBV病毒阳性型、微卫星不稳定型（MSI）、基因组稳定型（GS）和染色质不稳定型（CIN）,该分型对深入理解胃癌生物学行为的繁杂性,显示了重要意义,也引起了广泛关注。但是,用于指导临床实践,还有较远的距离。特别是其中的CIN亚型患者数量最多且均质性较差,由于研究不够深入,未能确定其确切特征进行细分,在药物疗效和预后判定方面一致性很低。随着治疗手段的进步,胃癌的生存显著延长,因此,时间和空间异质性越来越被认识。自肿瘤分子分型提出以来,关于分型是生物学上独立的实体还是有渐进关系的基本问题仍处于争论中,两种情况下的患者管理和治疗策略完全不同。假设每个静态样本相当于肿瘤进化中的一张快照,只要样本量足够大,那么每个样本的遗传印记将会占据发展轨迹的一部分,从而可以模拟时间序列采样,通过计算方法从静态样本中构建“动态”的疾病进程。本研究旨在从分子表达水平上构建胃癌TCGA分子亚型分类器及探索CIN亚型胃癌的异质性,利用大量静态样本模拟“动态”的CIN亚型胃癌进化过程,并基于进化模型识别免疫检查点抑制剂（ICB）治疗的优势人群及对ICB治疗无应答患者的可行性靶向药,进一步发现可预测治疗获益的生物标志物。方法:1.获取并预处理TCGA胃癌训练集（n=412）、13个GEO胃癌芯片数据集组成的验证集（total n=1250）和2个单细胞验证集（总细胞数61937）。2.联合多重比较的非参数k-w检验及Logistic-lasso回归初步筛选各亚型的特征基因。3.基于亚型特征基因,预测验证集样本的分子亚型及单细胞验证集中各上皮细胞簇的分子亚型。4.以KEGG为背景基因集的基因集富集分析（GSEA）反映各分子亚型的生物学特征。5.使用流形学习算法构建CIN亚型胃癌的进化模型。6.获取并预处理anti-PD1治疗转移性胃癌及其他4个非胃癌的ICB治疗数据集。7.使用TIDE算法和Submap算法预测不同进化轨迹CIN亚型样本对ICB的治疗反应。8.使用反卷积算法cibersort、EPIC及单样本富集分析（ss GSEA）推算不同进化轨迹CIN亚型胃癌的免疫浸润情况。9.基于配体-受体基因的相互结合概率推算细胞簇间MHCI和免疫检查点的通讯水平。10.使用加权基因共表达网络分析（WGCNA）识别CIN亚型向ICB有应答方向进化的相关基因网络及核心基因。11.使用核回归计算各CIN亚型胃癌进化轨迹的关键突变。12.获取CCLE细胞系数据集（n=37）及细胞系药敏数据集PRISM和CTRP。13.基于细胞系的药敏AUC值和CMAP工具,预测训练集和验证集样本的药敏信息。14.使用q RT-PCR和western blotting筛选MDK高表达细胞系和评价si RNA的敲减效率。15.使用GSEA和western blotting评价MDK与m TORC1通路的关系。16.使用MTS法和平板克隆实验评价细胞的增殖活力和对AZD8055的敏感性。17.使用western blotting检测MDK敲减前后不同浓度AZD8055对m TORC1通路蛋白的影响。结果:1.构建TCGA分子亚型分类器,其中CIN亚型胃癌在分子表达水平上具有异质性,可被进一步划分为3种CIN亚型,各亚型的预后和生物学特征显著差异。（1）筛选57个亚型特征基因在训练集中对EBV、MSI、GS和CIN亚型均有良好分类表现。k-means一致性聚类在最佳分类下可将CIN亚型进一步划分为3种亚型（CIN1、CIN2、CIN3）。（2）对亚型特征基因表达水平的比较显示六分子亚型在训练集和验证集中分类一致。GSEA显示EBV和GS亚型的特征分别为免疫激活和细胞粘附运动,MSI和CIN2亚型均与细胞增殖密切相关,CIN1和CIN3亚型与代谢途径联系紧密。预后较好的MSI和CIN3亚型发生肿瘤复发的比例低,预后更差的GS、CIN1和CIN2亚型在进展期肿瘤中比例上升且肿瘤复发概率高,其中以弥漫型胃癌为主的GS亚型主要复发为腹膜种植和腹水转移,以肠型胃癌为主的CIN2亚型倾向于发生肝脏和腹内淋巴结复发,CIN1亚型对各部位均有较高复发率。2.在分子表达水平上,CIN亚型胃癌的进化过程是从代谢改变到快速增殖。对CIN亚型肿瘤样本及上皮细胞构建的进化模型均显示出各CIN亚型在进化中具有渐进关系,主要体现为从代谢改变到快速增殖的进化过程。从正常上皮到增殖亚型CIN上皮的末端,肿瘤分化程度逐渐下降。CIN3亚型预后佳且远处复发概率低与其多位于进化早期阶段且和其他高分化胃癌上皮细胞有紧密的桥粒连接有关。3.CIN亚型胃癌在进化过程中形成一支类似MSI特征肿瘤的分支,该进化轨迹更可能从ICB治疗中获益。（1）从代谢型CIN肿瘤进化至增殖型CIN肿瘤分支点处时,少部分CIN亚型样本趋向于获得MSI亚型胃癌的基因特征而形成独立进化分支C1。对表达基因的分析显示,对比增殖型CIN胃癌末支C2,预测从早期克隆C3到C1分支的进化轨迹更能从ICB治疗中获益。（2）对肿瘤微环境（TME）的评估显示,C1分支样本的TME中有更高的激活CD4+T细胞、耗竭前的激活CD8+T细胞和M1型巨噬细胞浸润,且对比其他上皮细胞克隆,C1分支上皮细胞与CD8+T细胞间有更高水平的MHC-I及免疫检查点受体通讯。而C2分支样本TME中的CD8+T细胞主要为已耗竭的CD8+T细胞。（3）使用WGCNA识别与C3支进化至C1分支的拟时序时间变化显著正相关而与进化至C2末支无关的基因模块,模块中的关键基因网络显著富集于免疫炎性通路,显示对ICB治疗有应答的进化轨迹的CIN亚型胃癌有更高的炎性激活分子特征。其中网络核心基因NFKB1在CIN亚型胃癌中与多个免疫检查点基因的表达显著正相关,且NFKB1和网络核心基因signature在C1分支上皮细胞中的表达也显著高于C2分支。4.ARID1A和LRRK2被识别为反映CIN亚型胃癌向ICB治疗获益方向进化的特征突变基因。肿瘤在进化中累积突变增多,肿瘤突变负荷（TMB）水平随拟时序时间进展而升高,从C3支到C1分支对比至C2末支的进化轨迹,TMB上升程度更高但不显著。核回归分析显示ARID1A和LRRK2基因突变在初始克隆至进化分支点后形成两种命运,突变概率在预测对ICB获益的C1进化轨迹中逐步上升,而在对ICB无应答的C2末支中突变概率随进化时间逐步下降。NFKB1在ARID1A或LRRK2突变的CIN亚型胃癌中表达显著更高。5.对ICB治疗低应答的CIN亚型胃癌对m TOR抑制剂AZD8055敏感,且随肿瘤进化敏感性更高。在验证了使用岭回归基于胃癌细胞系药敏AUC值预测胃癌样本药敏AUC的可行性后,对ICB治疗低应答的C3支和C2末支样本的分析显示,C2末支样本对m TOR抑制剂普遍敏感,其中AZD8055在分别基于PRISM和CTRP药敏数据集对训练集和验证集的预测中有一致结果,且对比其他化合物,AZD8055在C3支中也有较低的药敏AUC。同时基于基因表达扰动的算法支持各CIN亚型均对AZD8055敏感。6.MDK可促进CIN亚型胃癌形成和进化,其高表达提示CIN亚型胃癌对AZD8055敏感。（1）MDK在CIN亚型胃癌样本及上皮细胞初始进化支的分支点后表达显著上升且在超过半数的CIN亚型胃癌上皮细胞中有表达。生存分析显示MDK是胃癌乃至泛实体瘤的显著预后不良因素。（2）在CIN亚型胃癌样本中,MDK正向相关基因显著富集于增殖和m TORC1通路,MDK表达水平与AZD8055的药敏AUC值显著负相关。在CIN亚型细胞系中,MDK敲减后肿瘤细胞的增殖活力显著下降。Western blotting显示MDK高表达的CIN亚型胃癌细胞系中m TORC1通路相关蛋白的磷酸化水平更高,且对AZD8055更敏感。MTS检测细胞增殖活力显示MDK敲减后的CIN亚型胃癌细胞对AZD8055的敏感性下降。作用于相同浓度的AZD8055后,Western blotting显示MDK敲减细胞中AZD8055对m TORC1的磷酸化抑制能力减弱,从而使细胞对AZD8055的敏感性下降。结论:1.在转录组水平上,CIN亚型胃癌具有异质性,可被再划分为预后和生物学特征显著差异的两个代谢亚型和一个增殖亚型。CIN亚型胃癌的进化过程主要体现为从代谢改变到快速增殖。2.少数CIN亚型胃癌向ICB治疗获益方向进化,其肿瘤微环境更炎性且激活,进化轨迹伴随更大程度的TMB上升。鉴定ARID1A和LRRK2为反映CIN亚型胃癌向ICB治疗获益方向进化的重要突变。3.AZD8055为对ICB无应答的CIN亚型胃癌的可行靶向药,且当促进CIN亚型胃癌发生和进化的重要基因MDK高表达时,CIN亚型胃癌对AZD8055更敏感。