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目的:精神分裂症是一种由遗传因素和环境因素共同影响的复杂疾病。早期的流行病学数据显示其有家族聚集倾向,并且双生子研究证明精神分裂症的可遗传性达60%-80%。目前,精神分裂症有效的治疗、预防手段及较高的复发率成为医学界的重大挑战。更为重要的是,精神分裂症患者的暴力攻击行为引起严重的社会危害,使该病成为法医精神病学和司法精神疾病鉴定的重点和热点。然而,由于精神分裂症的病理机制尚不明确并且其遗传指标存在异质性,使鉴定结果缺乏说服力和一致性。因此,精神分裂症的病理机制研究备受关注。精神分裂症病因学相关的神经递质包括五羟色胺,多巴胺及γ-氨基丁酸等,大量证据表明五羟色胺系统对精神分裂症的发生,药物治疗的应答以及健康人群的易感都有非常重要的作用。在五羟色胺系统中,五羟色胺受体(5-HTR)决定了五羟色胺神经递质的功能发挥及对众多生理功能的调节。5-HTR共有十四种亚型,其中最重要,也是分布最广泛的亚型为5-HT1A受体。5-HT1A受体由位于人五号常染色体的HTR1A基因编码,该基因仅有一个外显子而无内含子。相关研究发现在精神分裂症患者脑部区域存在5-HT1A自身受体表达的增加和突触后受体表达的减少。相对于受体脱敏,内在化或相关偶联通路的失活,受体表达水平的异常才是引起精神疾病易感和发生的根本原因。位于HTR1A基因5’启动子区的功能性位点rs6295(-1019G/C)与精神分裂症具有显著地关联,并且该多态性通过结合转录因子Deaf-1或Hes调节5-HT1A自身受体的表达。然而,在相关Meta分析中发现,被确定为精神分裂症的134个风险基因中并没有涉及HTR1A基因。本课题组前期的研究发现该基因的5’启动子区具有另一功能性位点rs113195492(-1068G/A),其G等位基因的频率在偏执型精神分裂症女性中显著高于健康女性,提示该多态性为精神分裂症的风险基因。但关于rs113195492和rs6295组成的单倍型对HTR1A基因表达的影响尚无研究数据。HTR1A基因5’调控区功能序列的研究主要集中于启动子区上游的750bp和对基因表达具有显著抑制作用的-1620 bp---1500bp序列。关于3’-UTR区功能序列结合的microRNA研究发现microRNA-135显著抑制HTR1A基因的表达。目前,涉及HTR1A基因5’调控区和3’-UTR区的功能序列研究较少,本实验欲通过研究5’调控区功能序列结合的转录因子和3’-UTR区结合的microRNA及上述两个SNPs组成的单倍型对HTR1A基因表达的影响,揭示该基因涉及精神分裂症易感的分子机制。研究方法:运用PCR技术获取用于单倍型,5’调控区和3’-UTR区功能序列研究的目的片段并进行pGL3或pmirGLO重组载体的构建。经过真核细胞的重组载体转染,检测不同单倍型及目的片段的双荧光素酶表达。JASPAR软件和TargetScan Human 7.2软件用于相关转录因子和microRNA的预测。运用电泳迁移率实验(EMSA)进行DNA与蛋白结合的验证。最后,合成转录因子的过表达载体和microRNA的mimics/inhibitors(模拟体/抑制子),通过Western blot和qRT-PCR实验进行转录因子和microRNA对HTR1A基因表达的功能性研究。相关的统计学分析由SPSS20.0软件进行,p<0.05代表具有显著统计学差异。结果:单因素方差分析结果显示在HEK-293和SK-N-SH两种细胞系中,rs113195492(G/A)和rs6295(G/C)组成的三种单倍型GC,GG和AG的相对荧光强度具有显著的差异。分别比较两两单倍型的荧光素酶表达,结果表明GG单倍型的相对荧光强度显著高于GC,p值分别为0.001和0.029。然而,单倍型AG和GG、GC和AG的相对荧光强度无明显差异(p>0.05)。分析5’启动子区目的片段的相对荧光强度时发现,序列-1124bp--+99bp表现出最强的转录活性。当截去序列-1550bp---1124bp时,相对荧光强度在两种细胞系中均表现出显著的增加。通过JASPAR软件对功能片段-1550bp---1124bp的预测及EMSA实验的验证,发现转录因子CEBPB结合于-1219bp---1209bp序列。功能研究实验结果表明CEBPB显著抑制双荧光素酶和HTR1A基因mRNA的表达(p<0.05),但对内源性5-HT1A受体表达的抑制作用不明显。3’-UTR区的+375bp--+443bp序列在HEK-293和U87细胞中显著抑制双荧光素酶表达,p值分别为0.035和<0.001,但对双荧光素酶的mRNA表达水平无显著作用。通过TargetScan Human 7.2和miRbase软件预测,发现hsa-miR-3177-5p和hsa-miR-3178分别结合于序列+377 bp--+384 bp和+392bp--+399bp。运用microRNA的mimics/inhibitors进行功能性研究时发现,hsa-miR-3177-5p和hsa-miR-3178对序列-17bp--+443bp的相对荧光强度和内源性5-HT1A受体的表达均具有显著地抑制作用(p<0.05)。结论:1、HTR1A基因5’启动子区多态性rs6295的G等位基因显著上调基因表达,而rs113195492对基因表达的调节作用不明显。2、转录因子CEBPB结合HTR1A基因的-1219bp---1209bp序列显著抑制HTR1A基因mRNA及双荧光素酶表达,但对内源性5-HT1A受体表达的抑制作用不明显。3、hsa-miR-3177-5p和hsa-miR-3178分别结合序列+377bp--+384bp和+392bp--+399bp发挥对5-HT1A受体表达的抑制作用。4、CEBPB,hsa-mi R-3177-5p和hsa-miR-3178对HTR1A基因和5-HT1A受体的表达具有重要的调节作用,可能参与精神分裂症的病理机制,有望成为司法精神疾病鉴定的遗传指标。