目的:宫颈癌排全球妇科肿瘤第二位。近年来,亚洲地区宫颈癌的发病率正在迅速上升,尤其是在发展中国家。众所周知HPV的持续性感染和宫颈癌的肿瘤发展过程紧密相连,但同时也有研究认为癌基因的异常表达同样可作为独立因素影响宫颈癌的发生发展。当前早期宫颈癌可以得到较有效控制,然而转移性或复发性宫颈癌预后仍较差。因此,更进一步探讨宫颈癌的发病机制对于预防、治疗及预后监管宫颈癌均意义非凡。长链非编码RNA（long non-coding RNAs,LncRNAs）是非编码RNA的一类,研究发现LncRNAs与肿瘤发生发展密切相关,并能够参与细胞内多种生物学过程的调控。我们通过GEPIA网站（http://gepia.cancer-pku.cn/）分析发现长链非编码RNA LINC00460的高表达与宫颈癌的不良预后密切相关。LINC00460是一个长链基因间非编码RNA,研究显示其在胃癌、脑膜瘤、卵巢癌、肺癌等多种恶性肿瘤中均发挥促癌基因的作用,然而目前尚未见有确切报道LINC00460对宫颈癌的作用,因此我们推测其也能够促进宫颈癌的发生发展。基于竞争性内源RNA（Competing endogenous RNA,ceRNA）的基因调控理论,人们对微小RNA（Micro RNA,miRNA）与LncRNAs的调控机制又有了新的认识。我们通过网络在线生物信息学工具Star Base（http://Star Base.sysu.edu.cn/）预测看到LINC00460上存在有miR-503-5p的靶向结合位点。MiR-503-5p为一个抗肿瘤的miRNA,研究显示其能够抑制膀胱癌、肺癌以及卵巢癌等恶性肿瘤的进展。更为重要的是,有报道显示miR-503-5p与宫颈癌的不良预后相关,并且能够通过对其下游靶基因的调控抑制宫颈癌细胞的增殖。基于以上分析我们推测LINC00460可能通过调控miR-503-5p影响宫颈癌的发生发展进程。本研究拟探讨LINC00460在宫颈癌组织及癌旁组织中的表达水平差异,并进一步分析长链非编码LINC00460表达水平差异是否与宫颈癌患者临床病理参数及超声检查结果具有相关性。我们还将探讨LINC00460表达水平改变对宫颈癌细胞增殖及凋亡等生物学功能的影响作用。再依据ceRNA靶向吸附miRNA理论探讨LINC00460促进宫颈癌增殖及凋亡的分子调控机制。方法:1、我们通过GEPIA网站分析发现LINC00460的高表达与宫颈癌的不良预后密切相关。收集中国医科大学附属盛京医院（中国沈阳）妇科手术经病理证实的30对宫颈癌组织及癌旁组织,所有组织标本离体后在液氮中冷冻,后于-80℃保存。同时收集全部患者的相关临床病理资料。所有患者均于术前行三维能量多普勒超声检查,评估血管分级及血流参数等指标。通过使用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）技术检测临床样本组织中的LINC00460的表达水平,并分析其表达水平差异与宫颈癌患者临床病理特性及超声检查结果的相关性。2、采用RT-qPCR方法检测LINC00460在四种宫颈癌细胞株（Siha、C-33A、Hela、CaSki）的基础表达情况,并筛选出两株LINC00460高表达的细胞株（Siha和Hela细胞）。构建LINC00460干扰载体以及阴性对照干扰载体,分别转染Siha和Hela细胞,实验分组:对照组、NC shRNA组、LINC00460 shRNA1组、LINC00460 shRNA2组。转染48h后采用RT-qPCR方法验证LINC00460在Siha和Hela细胞中的转染效率。接下来我们通过流式细胞术检测各组Siha和Hela细胞的细胞周期改变,应用MTT法检测各组宫颈癌细胞增殖活力情况,应用Western blot检测Ki67和cyclin D1的表达,以验证沉默LINC00460对宫颈癌细胞增殖的影响。3、通过流式细胞术及Hoechst染色检测细胞凋亡情况,Western blot检测凋亡相关蛋白Cleaved-caspase-3和Cleaved-PARP的表达,验证沉默LINC00460对宫颈癌细胞凋亡能力的影响。4、通过Star Base数据库预测miR-503-5p作为LINC00460的下游miRNA分子,构建含有miR-503-5p结合位点的野生型LINC00460载体以及结合位点突变的LINC00460载体,分别与NC mimic或miR-503-5p mimic共转染工具细胞（HEK-293T）,实验分四组:WT-LINC00460+NC mimic组、MUT-LINC00460+NC mimic组、WT-LINC00460+miR-503-5p mimic组、MUT-LINC00460+miR-503-5p mimic组,之后采用双荧光素酶实验来验证LINC00460与miR-503-5p靶向结合情况。按照第二部分实验分组:对照组、NC shRNA组、LINC00460 shRNA1组、LINC00460shRNA2组,RT-qPCR方法检测各组Siha和Hela细胞中miR-503-5p的表达水平,应用Western blot检测法检测AKT2,HMGA2,SHOX2蛋白表达,以确认LINC00460对miR-503-5p及其下游靶基因的调控作用。5、设计挽救实验,分别采用LINC00460shRNA1以及miR-503-5p inhibitor、NC inhibitor共转染Siha细胞,实验分组:LINC00460 shRNA1+NC inhibitor组、LINC00460 shRNA1+miR-503-5p inhibitor组。通过MTT方法检测细胞增殖活力情况,通过流式细胞术技术检测细胞周期变化并检测细胞凋亡情况,应用Western blot检测miR-503-5p下游靶基因AKT2、HMGA2、SHOX2及cyclin D1和Cleaved-caspase-3的表达。6、体内裸鼠成瘤实验验证沉默LINC00460表达后对裸鼠成瘤能力影响,采用RT-qPCR检测瘤体组织中LINC000460和miR-503-5p的表达,免疫组化方法检测瘤体组织Ki67蛋白表达,通过TUNEL法观察细胞凋亡情况,Western blot检测AKT2,HMGA2,SHOX2蛋白表达,进一步在体内验证沉默LINC00460对miR-503-5p和其下游靶基因的影响,验证LINC00460对体内宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响。结果:1、RT-qPCR结果显示LINC00460在宫颈癌患者肿瘤组织中的表达水平显著高于癌旁正常组织（P<0.01）;宫颈癌组织中LINC00460的差异表达与宫颈癌肿瘤组织分化程度有关（P<0.05）,与宫颈癌患者有无淋巴结转移相关（P<0.05）,却和患者的年龄、肿块的大小、患者FIGO分期以及病理类型无确切的相关性（P>0.05）;宫颈癌组织中LINC00460表达水平的高低与超声检查结果超声血管分级相关（P<0.05）。2、MTT检测显示沉默LINC00460显著减少宫颈癌细胞增殖活力;流式细胞仪细胞周期显示沉默LINC00460促进宫颈癌细胞周期阻滞在G1期,抑制宫颈癌细胞周期G1/S过渡（P<0.05）;沉默LINC00460抑制Ki67和cyclin D1的表达（P<0.05）,提示沉默LINC00460可抑制宫颈癌的增殖能力。3、流式细胞术检测细胞凋亡和Hoechst染色显示沉默LINC00460使宫颈癌细胞发生凋亡细胞明显增多,Cleaved-caspase-3和Cleaved-PARP的表达增高（P<0.05）,提示沉默LINC00460可促进宫颈癌细胞的凋亡。4、通过Star Base网站预测发现LINC00460和miR-503-5p有靶向结合位点,双荧光素酶实验显示当293T细胞转染WT-LINC00460时,miR-503-5p mimic能够明显减低其内荧光素酶的活性（P<0.01）,而对转染MUT-LINC00460的293T细胞的荧光素酶活性的影响不明显。RT-qPCR方法检测发现沉默LINC00460能够显著上调Siha和Hela细胞中miR-503-5p的表达水平（P<0.01）,Western blot检测发现沉默LINC00460能够使宫颈癌细胞内miR-503-5p靶基因AKT2,HMGA2,SHOX2的表达减低（P<0.01）。提示LINC00460可与miR-503-5p靶向结合,沉默LINC00460可增强miR-503-5p的表达并抑制其靶基因在宫颈癌细胞中的表达。5、挽救实验显示与共转染LINC00460 shRNA1+NC inhibitor组相比,共转染LINC00460 shRNA1+miR-503-5p inhibitor组细胞增殖能力明显提高,诱导宫颈癌细胞G1/S过渡（P<0.05）,凋亡细胞比例明显降低（P<0.05）,cyclin D1水平显著增加（P<0.05）,Cleaved-caspase-3水平显著下降（P<0.05）,miR-503-5p下游靶基因AKT2、HMGA2、SHOX2的表达显著上调（P<0.05）,验证了LINC00460靶向miR-503-5p并调控miR-503-5p在宫颈癌细胞中的下游靶基因AKT2,HMGA2,SHOX2,进而影响宫颈癌细胞的增殖和凋亡。证实了抑制miR-503-5p逆转了LINC00460沉默引起的宫颈癌细胞增殖抑制和miR-503-5p靶基因表达抑制及促进细胞凋亡的情况。6、体内裸鼠成瘤实验结果发现LINC00460 shRNA组移植瘤的生长速度、体积、重量均明显低于NC shRNA组（P<0.01）,沉默LINC00460可抑制裸鼠体内宫颈癌肿瘤生长能力。RT-qPCR结果显示LINC00460 shRNA组瘤体组织中LINC00460的表达水平明显低于NC shRNA组（P<0.01）,而miR-503-5p的表达水平明显高于NC shRNA组（P<0.01）。免疫组化结果ki67在LINC00460 shRNA组肿瘤组织中的表达水平明显低于NC shRNA组（P<0.01）。TUNEL法显示LINC00460 shRNA组瘤体组织中凋亡细胞较多。Western blot技术检测结果显示与NC shRNA组相比较LINC00460 shRNA组宫颈移植瘤肿瘤组织中的AKT2、HMGA2、SHOX2的蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。可见体内沉默LINC00460可抑制宫颈癌移植瘤肿瘤生长,促进miR-503-5p表达水平上调,促进宫颈癌细胞凋亡的过程,同时抑制肿瘤组织中宫颈癌细胞增殖能力以及miR-503-5p下游靶基因的表达。结论:1、本研究证实了LINC00460在宫颈癌组织及细胞株中表达上调,提示LINC00460与宫颈癌的发生发展相关。2、沉默LINC00460表达,可抑制体外宫颈癌细胞增殖能力。3、沉默LINC00460表达,能够增强体外宫颈癌细胞的凋亡能力。4、LINC00460靶向miR-503-5p并调控miR-503-5p在宫颈癌细胞中的下游靶基因AKT2,HMGA2,SHOX2。5、LINC00460通过海绵吸附miR-503-5p调控宫颈癌细胞的增殖和凋亡。6、在体内LINC00460调控miR-503-5p的水平,沉默LINC00460可抑制裸鼠体内宫颈癌肿瘤生长能力和宫颈癌细胞的增殖,促进肿瘤中宫颈癌细胞的凋亡。提示LINC00460在宫颈癌发病过程中可能发挥着促癌基因的作用,有望成为宫颈癌治疗的新靶点。