心肌肥大是心肌细胞对多种病理刺激产生的一种适应性反应，是引起多种心血管疾病的重要危险因素之一。心肌肥大相关疾病如高血压、心衰等普遍存在且严重威胁人类健康。现有药物治疗心肌肥大的效果并不理想，因此寻找能够干预心肌肥大的新的药物靶点对于开发治疗心肌肥大的药物具有重要意义。 本论文探讨了ECE-1家族对血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)诱导的心肌细胞肥大的调控作用，以及ECE-1各亚型在此调控过程中的主次地位；体外表达在肥大过程中起主要作用的亚型ECE-1c，构建以该亚型为靶点的体外药物筛选体系并进行了短肽抑制剂的合成和体外筛选；评价了短肽抑制剂对心肌肥大的保护作用，为研究开发以ECE-1c亚型为靶点的治疗心肌肥大及相关疾病的药物提供理论依据及可进行高通量筛选的体外筛选体系。 第一章 ECE-1及其亚型在调控AngⅡ诱导的心肌细胞肥大过程中的作用 目的： ET-1已经被证明是参与心肌肥大过程的重要因子，作为其产生过程中的限速酶，ECE-1的表达量和活性直接影响ET-1的生成量。而ECE-1与心肌肥大的直接关系却未见报道。因此我们观察了ECE-1在AngⅡ诱导的心肌细胞肥大过程中的变化，并采用小分子RNA干扰序列(small interference RNA，siRNA)沉默心肌细胞中ECE-1表达的方法探讨了ECE-1在心肌肥大调控中的作用。同时，我们也观察了ECE-1四个亚型在正常心肌细胞中的mRNA丰度以及四个亚型在心肌细胞肥大过程中的mRNA水平变化，探讨了ECE-1四个亚型在心肌肥大调控中的主次地位。 方法： 1、体外培养SD乳鼠心肌细胞，α—横纹肌肌动蛋白(α—sarcomeric actin)免疫组化染色法鉴定心肌细胞的纯度。 2、以0.1μM AngⅡ分别刺激心肌细胞12，24和36h，RT—PCR测定肥大因子心房利钠肽(Atrial natriuretic factor，ANF)，β—肌球蛋白重链(β—myosin heavy chain，β—MHC)的mRNA变化，倒置显微镜观察心肌细胞表面积的变化。 3、以0.1μM AngⅡ分别刺激心肌细胞12，24和36h，western—blot方法检测ECE-1的蛋白表达变化。 4、Fluorescent Oligo与转染试剂Lipofectamin2000以不同比例转染心肌细胞后48h，荧光显微镜观察转染效率。使用siRNA干扰序列RSS331827转染心肌细胞，RT—PCR和western—blot方法测定ECE-1的表达被沉默的程度。 5、siRNA negative control low GC和RSS331827分别转染心肌细胞后48h，加入0.1μM AngⅡ刺激心肌细胞24h，RT—PCR方法测定ANF，β—MHC的mRNA变化，倒置显微镜观察心肌细胞表面积的变化。 6、RT—PCR和Realtime—PCR方法分别测定了四个亚型在正常心肌细胞中的mRNA丰度。 7、以0.1μM AngⅡ分别刺激心肌细胞12，24和36h，RT—PCR和Realtime—PCR方法分别检测各个亚型的mRNA水平变化。 结论： 1、原代培养的乳鼠心肌细胞的形态特征符合心肌细胞的形态特征，心肌细胞纯度高于95％，可以用于实验。 2、AngⅡ刺激心肌细胞24h可以诱导心肌细胞产生明显肥大反应。 3、ECE-1在AngⅡ诱导的心肌肥大过程中表达显著增加；下调ECE-1的表达可以显著抑制AngⅡ诱导的心肌肥大反应，证明ECE-1与AngⅡ诱导的心肌细胞肥大过程有密切关系。 4、心肌细胞中四种亚型均有表达，其中表达量最高的亚型为c亚型，其次为b，d亚型，a亚型最少。AngⅡ诱导的心肌肥大反应过程中，a和c亚型的mRNA水平呈时间依赖性显著上调，而b和d亚型mRNA水平无显著变化。综合考虑四个亚型在心肌细胞中的mRNA水平和肥大过程中的变化，我们认为相比于a，b和d亚型，c亚型与心肌肥大的关系更为密切。 第二章以ECE-1c为靶点的体外药物筛选体系构建 目的： 从第一章的结果中，我们知道ECE-1在调控心肌肥大过程中起重要作用，以及这种调控作用主要是由ECE-1c亚型来实现的。为了筛选具有ECE-1c抑制活性的化合物，我们利用经典的分子克隆方法在体外表达了大鼠ECE-1c蛋白并获得了稳定表达ECE-1c的CHO单克隆细胞系，并利用表达的ECE-1c与其天然底物大鼠big ET-1建立了测定ECE-1c酶活性的反应体系，摸索确定了最佳的反应条件。该活性评价体系可以用来在体外快速多样本地筛选对ECE-1c具有抑制作用的化合物。 方法： 1、提取SD大鼠颈总动脉mRNA，用RT—PCR方法得到ECE-1c的读码框DNA片段。将该片段克隆至载体质粒pCDNA3.1中构建重组质粒，并测序鉴定。 2、将重组质粒稳定转染CHO细胞，使用有限稀释法在G418压力下筛选稳定表达单细胞克隆，挑取多个克隆使用western—blot测定各个克隆中ECE-1c的表达量，表达量最高的克隆被保存下来持续培养传代3个月，RT—PCR和western—blot测定ECE-1c的稳定表达情况。 3、以表达的大鼠ECE-1c和其天然底物大鼠big ET-1以及相应的缓冲体系建立了ECE-1c酶反应体系，ELISA法测定反应生成的ET-1的量来反映酶活性。测定了表达的大鼠ECE-1c的酶动力学常数。 结论： 1、构建了ECE-1c—pCDNA3.1重组质粒。 2、在CHO细胞中稳定表达了大鼠ECE-1c蛋白，表达的蛋白具有正常的酶活性。 3、筛选得到的ECE-1c稳定表达单细胞克隆使我们可以持续低成本的获得表达的大鼠ECE-1c蛋白，以此为基础建立的酶反应体系能够快速地多样本地进行化合物的筛选。 第三章 ECE-1c抑制性短肽的合成、筛选及其对心肌肥大的保护作用 目的： 为了得到具有ECE-1c抑制活性的短肽，并初步评价得到的短肽是否能够抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大。我们以大鼠bigET-1为模板设计合成了13条短肽。利用构建的体外筛选系统对短肽的ECE-1c抑制作用进行了筛选，挑选出了抑制效果最好的2条短肽，进一步使用AngⅡ诱导的心肌细胞肥大模型对短肽的心肌肥大的保护作用进行了评价。 方法： 1、短肽采用固相合成技术进行合成，使用制备型HPLC进行纯化。 2、将合成纯化的短肽加入ECE-1c酶反应测定体系，对短肽体外抑制ECE-1c活性的能力进行评价。 3、MTT法评价了P8和P9对心肌细胞活力的影响。 4、使用筛选到的短肽孵育心肌细胞1h，再与AngⅡ(0.1μM)共同处理心肌细胞24h。RT—PCR方法测定肥大因子β—MHC的mRNA变化，倒置显微镜观察心肌细胞表面积的变化。 结论： 1、Pl—P13在体外表现出不同程度的ECE-1c活性抑制作用。在13条短肽中，P8和P9具有较强的ECE-1c活性抑制作用。 2、P8和P9浓度至100μM对心肌细胞活力无明显影响。P8和P9可以显著抑制AngⅡ诱导的肥大反应，说明通过抑制ECE-1c的酶活性可以减轻AngⅡ诱导的心肌细胞肥大反应，AngⅡ是诱导心肌肥大的重要因子，提示ECE-1c可能成为寻找新型抗心肌肥大药物的靶标。