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目的:肝细胞肝癌(human hepatocellular carcinoma HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一,恶性程度高,易侵袭转移,预后差,因而探索肝细胞癌的发病及侵袭转移机制是临床研究的一大挑战。肝癌生长速度快,造成局部组织严重缺氧,缺氧状况下中肿瘤仍能不断增殖,浸润,极易侵袭转移和复发,这也是肝癌研究的重点及临床治疗的难点,但肝癌侵袭转移的机制尚不清楚。此过程中起关键作用的是缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1 HIF-1)。HIF-1是迄今为止发现的唯一一个特异性缺氧状态下发挥活性的转录因子。HIF-1α在肿瘤组织中广泛表达,对维持肿瘤细胞的能量代谢、肿瘤血管生成、促进肿瘤细胞增殖和转移起重要作用。本研究通过应用HIF-1α抑制剂YC-1和HIF-1α的反义寡核苷酸分别处理SMMC-7721肝癌细胞,观察不同药物浓度对肝癌细胞增殖的作用和对SMMC-7721细胞周期及凋亡率的影响,检测bcl-2, bax, survivin mRNA和蛋白表达量的变化,明确缺氧诱导因子-1对肝癌细胞周期和增殖调亡影响及可能机制,为明确肝癌侵袭转移的机制及采取相应的治疗措施提供理论依据。方法:肝癌细胞系SMMC-7721分对照组和试验组。对照组细胞常规培养,试验组细胞分别施加HIF-1α抑制剂YC-1和HIF-1α的反义寡核苷酸干预,设浓度梯度和时间梯度。MTT方法检测不同药物浓度对SMMC-7721细胞的增殖的作用;采用FCM检测不同时间点、不同药物浓度对SMMC-7721细胞周期和凋亡率的影响;采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,测定细胞bcl-2, bax, survivin mRNA表达的变化,以β-actin作为内参照标准,通过凝胶扫描仪对扩增产物进行DNA电泳条带的光密度值分析,将bcl-2, bax, survivin与β-actin比值作为bcl-2, bax, survivin mRNA表达水平的参数,对bcl-2, bax, survivin产物相对定量;以Western blot方法检测SMMC-7721细胞胞浆bcl-2, bax, survivin蛋白表达的变化,同样以β-actin作为内参照标准,对bcl-2, bax, survivin蛋白进行相对定量分析。所有数据均以x±s表示,采用SPSS13.0统计分析软件进行方差分析(GLM过程)检验,P<0.05为有显著差异。结果1 MTT比色法显示:1.1 YC-1对SMMC-7721细胞增殖具有抑制作用。不同浓度YC-1处理细胞后,与对照组相比,各处理组OD值均有显著下降,差异具有显著性(P<0.05)。各实验组间比较,差异亦具有显著性(P<0.05)。YC-1处理细胞不同时间后,与对照组相比,各处理组OD值均有显著下降,差异具有显著性(P<0.05)。各实验组间比较,差异亦具有显著性(P<0.05)。随YC-1处理浓度的增大、作用时间的延长,OD值显著下降,即YC-1对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用呈明显的时间-剂量依赖效应,(P<0.05)(Fig.2,Table 1)。1.2 ASODN对SMMC-7721细胞增殖具有抑制作用。不同浓度ASODN处理细胞后,与对照组相比,各处理组OD值均有显著下降,差异具有显著性(P<0.05)。各实验组间比较,差异亦具有显著性(P<0.05)。ASODN处理细胞不同时间后,与对照组相比,各处理组OD值均有显著下降,差异具有显著性(P<0.05)。各实验组间比较,差异亦具有显著性(P<0.05)。随ASODN处理浓度的增大、作用时间的延长,OD值显著下降,即ASODN对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用呈明显的时间-剂量依赖效应(Fig.3,Table 2) (P<0.05)。2流式细胞仪检测细胞周期分布显示:2.1不同浓度YC-1处理细胞后,与对照组相比,各处理组G0/G1期细胞增多(P<0.05),S期细胞减少(P<0.05),G2/M期细胞变化不明显(P>0.05)。各实验组间比较,差异亦具有显著性(P<0.05)。YC-1处理细胞不同时间后,与对照组相比,各处理组G0/G1期细胞增多(P<0.05),S期细胞减少(P<0.05),G2/M期细胞变化不明显(P>0.05)。各实验组间比较,差异亦具有显著性(P<0.05)。即YC-1可阻滞SMMC-7721细胞周期进程于G0/G1期,该作用呈时间-剂量依赖效应(Fig 5、9,Table 3、4)。随YC-1浓度的增大和时间的延长,凋亡百分率逐渐升高(Fig.6,Table 7),(P<0.05);(Fig.10,Table 9),(P<0.05),呈时间-剂量依赖效应。2.2不同浓度ASODN处理细胞后,与对照组相比,各处理组G0/G1期细胞增多(P<0.05),S期细胞减少(P<0.05),G2/M期细胞变化不明显(P>0.05)。各实验组间比较,差异亦具有显著性(P<0.05)。ASODN处理细胞不同时间后,与对照组相比,各处理组G0/G1期细胞增多(P<0.05),S期细胞减少(P<0.05),G2/M期细胞变化不明显(P>0.05)。各实验组间比较,差异亦具有显著性(P<0.05)。即ASODN可阻滞SMMC-7721细胞周期进程于G0/G1期,该作用呈时间-剂量依赖效应(Fig.7、11,Table 5、6)。随ASODN浓度的增大和时间的延长,凋亡百分率升高(Fig.4,Table 8),(P<0.05);(Fig.8,Table 10),(P<0.05),呈时间-剂量依赖效应。3 PCR结果显示:3.1不同浓度YC-1处理细胞不同时间后,与对照组相比,各实验组bcl-2 mRNA和survivin mRNA表达均有显著下降,差异具有显著性(P<0.05),各实验组间比较,差异亦具有显著性(P<0.05)。而bax的mRNA无明显变化趋势(P>0.05)。随YC-1浓度的增大和时间的延长,SMMC-7721细胞bcl-2 mRNA (Fig.12、14,Table 11)和survivin mRNA(Fig.20、22,Table 13)表达显著下降,均呈浓度依赖性和时间依赖性(P<0.05)。而bax的mRNA无明显变化趋势(Fig.16、18,Table 12) (P>0.05)。3.2不同浓度ASODN处理细胞不同时间后,与对照组相比,各实验组bcl-2 mRNA和survivin mRNA表达均有显著下降,差异具有显著性(P<0.05)。各实验组间比较,差异亦具有显著性(P<0.05)。而bax的mRNA无明显变化趋势(P>0.05)。随ASODN浓度的增大和时间的延长,bcl-2 mRNA(Fig.13、15,Table 14)和survivin mRNA (Fig.21、23,Table 16)表达显著下降,均呈浓度依赖性和时间依赖性(P<0.05)。而bax的mRNA无明显变化趋势(Fig.17、19,Table 15) (P>0.05)。4 Western结果显示:4.1不同浓度YC-1处理细胞不同时间后,与对照组相比,各实验组bcl-2和survivin的蛋白表达显著下降, bax的蛋白表达显著增加,差异具有显著性(P<0.05)。各实验组间比较,差异亦具有显著性(P<0.05)。随YC-1浓度的增大和时间的延长,SMMC-7721细胞bcl-2 (Fig.24、26,Table 14)和survivin (Fig.33、35,Table 22)蛋白表达显著下降,bax的蛋白显著增加(Fig.29、31,Table 18),均呈浓度依赖性和时间依赖性(P<0.05)。4.2不同浓度ASODN处理细胞不同时间后,与对照组相比,各实验组bcl-2,survivin的蛋白表达逐渐减少, bax的蛋白逐渐增加,差异具有显著性(P<0.05)。各实验组间比较,差异亦具有显著性(P<0.05)。随ASODN浓度的增大和时间的延长,bcl-2 (Fig.25、27,Table 17)和survivin (Fig.32、34,Table 19)蛋白表达显著下降, bax的蛋白显著增加(Fig.28、30,Table 21),均呈浓度依赖性和时间依赖性(P<0.05)。结论1通过MTT法证实了YC-1和ASODN具有对SMMC-7721肝癌细胞株增殖抑制作用,呈明显的时间-剂量依赖效应,为肝癌的综合治疗提供了新的选择。2通过对细胞周期的测定,证明YC-1和ASODN可以阻滞肝癌细胞于G0/G1期,抑制细胞增殖,影响细胞周期进程,作用呈明显的时间-剂量依赖效应。3通过对细胞凋亡率的测定,证明YC-1和ASODN可以诱导肝癌细胞的调亡,凋亡率随药物浓度增大和作用时间的延长增高,且呈明显的时间-剂量依赖效应。4 HIF-1α促进增殖抑制凋亡的机制是上调肝癌细胞Survivin和bcl-2的表达,下调bax的表达。这种作用呈明显的时间-剂量依赖效应。5针对HIF-1α的抑制剂和反义寡核苷酸的应用,为肝癌的治疗提供了新的思路.