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第一部分:端粒的延长替代表型在胰腺神经内分泌肿瘤进展中的作用及分子病理学特征的探索
目的：
胰腺神经内分泌肿瘤(Pancreatic neuroendocrine neoplasms，PanNENs)具有异质性的进展潜能，生物学行为难以预测。2017版WHO分期和分级系统对疾病的进展有显著的预测价值。即使在同一分期或分级情况下，PanNENs的生物学行为依然存在差异。现有的风险评估体系并不能适用于所有患者。最近欧美等国家的研究报道端粒的延长替代机制(alternative lengthening oftelomeres，ALT)与PanNENs不良预后有关，但中国地区尚未见报道。散发性PanNENs中ALT激活相关的分子遗传学基础尚未明确，DNA修复蛋白缺失及DNA“甲基化”是否与ALT激活相关尚未见报道。本研究将探索ALT激活在PanNENs中的预后意义、ALT激活相关的分子特征、ALT激活与DNA修复蛋白缺失和DNA甲基化的关系，研究将可能揭示一种特殊亚型PanNENs的进展机制，为PanNENs的更合理的预后评估和“靶向ALT”的治疗策略提供理论依据。
方法：
1.回顾性分析北京协和医院病理档案，纳入了156例PanNENs病例，收集相应标本和患者的基本信息及随访信息。通过免疫组化检测ALT激活相关蛋白DAXX、ATRX及DNA修复蛋白MLH1、PMS2、MSH2、MSH6、MGMT的表达情况，通过端粒特异性-荧光原位杂交检测ALT的状态，分析临床病理学参数、DAXX、ATRX的表达、DNA修复蛋白的表达与ALT激活之间的相关性，评估ALT及临床病理参数的预后价值。
2.通过甲基化特异的多重连接探针扩增技术(Methylation specific-multiplex ligation-dependent probe amplification，MS-MLPA)检测27例PanNENs和10例的正常胰腺组织DNA修复基因的甲基化程度，比较ALT阳性和ALT阴性肿瘤组织的DNA修复基因甲基化程度差异。
3.通过靶向的高通量测序技术和sanger测序技术检测30对PanNENs及相应的正常组织的基因突变情况，通过生物学信息分析和统计学分析生殖细胞突变和体细胞突变的高频突变基因，确定ALT激活相关的分子突变特征和PanNENs预后相关的分子突变特征。
结果：
1.本研究中，患者的中位随访时间为53个月，范围为5-185个月。估计的5年和10年总生存率分别为91％和78％，高于西方的群体研究。ALT阳性PanNETs在分级较高、Ki-67指数较高、体积较大、分期较晚的肿瘤中更为常见(P＜0.001)。ALT阳性的PanNETs也与淋巴结转移(P＜0.001)、远处转移(P＜0.001)、非胰岛素瘤(P＜0.001)密切相关。ALT激活与ATRX或DAXX的表达丢失显著相关(P＜0.001)。在G2级PanNENs中ALT的阳性患者的无进展生存率(Progression free survival，PFS)显著低于ALT阴性患者(P＜0.001)。在多因素生存分析中，较高的分级和较晚的TNM分期为PanNETs无进展生存的独立预后因素。
2.PanNETs中未见明确MLH1、PMS2、MSH2和MSH6的表达缺失。138例PanNENs中有9例(6.5％)显示MGMT的表达降低或低表达，MGMT的表达降低与ALT的激活显著相关(P＜0.001)。探针MLH1Ⅳ、MGMTⅢ的Dm值在ALT-阳性-组高于ALT-阴性-组(P＜0.05)。
3.Sanger测序结果显示，30例PanNENs中共有3例样本(10％)显示DAXX的非同义突变。靶向高通量测序的结果显示，MEN1为最常见的显著突变基因，存在于33％(10/30)的肿瘤中。DNA损伤修复基因、染色质重塑相关基因、MEN1/DAXX/ATRX的突变主要分布在ALT阳性肿瘤中，但只有MEN1/DAXX/ATRX的样本间突变频率在ALT阳性肿瘤显著高于ALT阴性肿瘤(P=0.038)。此外肿瘤抑制基因、酪氨酸激酶及其受体的编码基因显示了较高的体细胞突变频率。
结论：
本研究中PanNENs患者的5年和10年总生存率分别为91％和78％，高于西方的群体研究。G2级PanNETs中ALT的阳性患者具有较高的进展风险。较高的级别和较晚的TNM是PanNETs进展风险增高的独立预测因素。DNA错配修复蛋白的表达缺失和DNA错配修复基因突变在PanNENs是相对低频的事件。DNA修复基因MLH1和MGMT的甲基化程度改变与ALT激活之间存在相关关系。DNA损伤修复基因、染色质重塑相关基因和MEN1/DAXX/ATRX的突变是ALT的激活中重要的分子事件。肿瘤抑制基因、酪氨酸激酶及其受体的编码基因在PanNENs的进展中发挥作用。综上所述，我们证实在G2级别PanNETs中，ALT阳性代表进展风险较高的一个亚型。DNA修复基因MLH1和MGMT的甲基化程度改变、DNA损伤修复基因的突变、染色质重塑相关基因和MEN1/DAXX/ATRX的突变是ALT激活过程伴随的重要分子事件。
第二部分:高MCM7增殖指数:早期胰腺神经内分泌肿瘤进展的有力预测指标
胰腺神经内分泌肿瘤(Pancreatic neuroendocrine neoplasms，PanNENs)有一个难以预测的临床过程，恶性潜能从惰性到高度恶性不等。目前尚无可靠的免疫组织化学标志物可用于PanNENs早期生物学行为的预测。微小染色体维持蛋白7(Minichromosome maintenance protein 7，MCM7)是细胞增殖的强有力的标志物。MCM7的表达是否与PanNENs的进展风险有关，目前仍不清楚。我们对156例PanNENs患者的分期、分级、Ki-67指数、MCM7指数等病理特征和临床行为进行了评估。较高的MCM7增殖指数与较大的肿瘤体积(P＜0.001)，无功能肿瘤(P＜0.001)，分级升高(P＜0.001)、TNM高分期(P＜0.001)显著相关。多因素分析中，G2/G3(危险比(hazardratio，HR)，2.21;95％置信区间(confidenceinterval，CI)，1.35-3.62;P＜0.001)，Ⅲ/Ⅳ期(HR2.11;95％置信区间，1.31-3.41;MCM7标记指数(labelingindex，LI)＞5％(HR，3.81;95％置信区间，1.30-11.17;P=0.02)为独立负向预后因素，与Ⅰ-Ⅳ期肿瘤进展风险相关。MCM7LI＞5％与Ⅰ-Ⅴ、Ⅰ-Ⅲ、和Ⅰ-Ⅱ期的肿瘤进展风险增加有关。我们的研究证实，MCM7是评估PanNENs的进展一个有价值的指标，尤其对于早期疾病和无远处转移的患者。
目的：
胰腺神经内分泌肿瘤(Pancreatic neuroendocrine neoplasms，PanNENs)具有异质性的进展潜能，生物学行为难以预测。2017版WHO分期和分级系统对疾病的进展有显著的预测价值。即使在同一分期或分级情况下，PanNENs的生物学行为依然存在差异。现有的风险评估体系并不能适用于所有患者。最近欧美等国家的研究报道端粒的延长替代机制(alternative lengthening oftelomeres，ALT)与PanNENs不良预后有关，但中国地区尚未见报道。散发性PanNENs中ALT激活相关的分子遗传学基础尚未明确，DNA修复蛋白缺失及DNA“甲基化”是否与ALT激活相关尚未见报道。本研究将探索ALT激活在PanNENs中的预后意义、ALT激活相关的分子特征、ALT激活与DNA修复蛋白缺失和DNA甲基化的关系，研究将可能揭示一种特殊亚型PanNENs的进展机制，为PanNENs的更合理的预后评估和“靶向ALT”的治疗策略提供理论依据。
方法：
1.回顾性分析北京协和医院病理档案，纳入了156例PanNENs病例，收集相应标本和患者的基本信息及随访信息。通过免疫组化检测ALT激活相关蛋白DAXX、ATRX及DNA修复蛋白MLH1、PMS2、MSH2、MSH6、MGMT的表达情况，通过端粒特异性-荧光原位杂交检测ALT的状态，分析临床病理学参数、DAXX、ATRX的表达、DNA修复蛋白的表达与ALT激活之间的相关性，评估ALT及临床病理参数的预后价值。
2.通过甲基化特异的多重连接探针扩增技术(Methylation specific-multiplex ligation-dependent probe amplification，MS-MLPA)检测27例PanNENs和10例的正常胰腺组织DNA修复基因的甲基化程度，比较ALT阳性和ALT阴性肿瘤组织的DNA修复基因甲基化程度差异。
3.通过靶向的高通量测序技术和sanger测序技术检测30对PanNENs及相应的正常组织的基因突变情况，通过生物学信息分析和统计学分析生殖细胞突变和体细胞突变的高频突变基因，确定ALT激活相关的分子突变特征和PanNENs预后相关的分子突变特征。
结果：
1.本研究中，患者的中位随访时间为53个月，范围为5-185个月。估计的5年和10年总生存率分别为91％和78％，高于西方的群体研究。ALT阳性PanNETs在分级较高、Ki-67指数较高、体积较大、分期较晚的肿瘤中更为常见(P＜0.001)。ALT阳性的PanNETs也与淋巴结转移(P＜0.001)、远处转移(P＜0.001)、非胰岛素瘤(P＜0.001)密切相关。ALT激活与ATRX或DAXX的表达丢失显著相关(P＜0.001)。在G2级PanNENs中ALT的阳性患者的无进展生存率(Progression free survival，PFS)显著低于ALT阴性患者(P＜0.001)。在多因素生存分析中，较高的分级和较晚的TNM分期为PanNETs无进展生存的独立预后因素。
2.PanNETs中未见明确MLH1、PMS2、MSH2和MSH6的表达缺失。138例PanNENs中有9例(6.5％)显示MGMT的表达降低或低表达，MGMT的表达降低与ALT的激活显著相关(P＜0.001)。探针MLH1Ⅳ、MGMTⅢ的Dm值在ALT-阳性-组高于ALT-阴性-组(P＜0.05)。
3.Sanger测序结果显示，30例PanNENs中共有3例样本(10％)显示DAXX的非同义突变。靶向高通量测序的结果显示，MEN1为最常见的显著突变基因，存在于33％(10/30)的肿瘤中。DNA损伤修复基因、染色质重塑相关基因、MEN1/DAXX/ATRX的突变主要分布在ALT阳性肿瘤中，但只有MEN1/DAXX/ATRX的样本间突变频率在ALT阳性肿瘤显著高于ALT阴性肿瘤(P=0.038)。此外肿瘤抑制基因、酪氨酸激酶及其受体的编码基因显示了较高的体细胞突变频率。
结论：
本研究中PanNENs患者的5年和10年总生存率分别为91％和78％，高于西方的群体研究。G2级PanNETs中ALT的阳性患者具有较高的进展风险。较高的级别和较晚的TNM是PanNETs进展风险增高的独立预测因素。DNA错配修复蛋白的表达缺失和DNA错配修复基因突变在PanNENs是相对低频的事件。DNA修复基因MLH1和MGMT的甲基化程度改变与ALT激活之间存在相关关系。DNA损伤修复基因、染色质重塑相关基因和MEN1/DAXX/ATRX的突变是ALT的激活中重要的分子事件。肿瘤抑制基因、酪氨酸激酶及其受体的编码基因在PanNENs的进展中发挥作用。综上所述，我们证实在G2级别PanNETs中，ALT阳性代表进展风险较高的一个亚型。DNA修复基因MLH1和MGMT的甲基化程度改变、DNA损伤修复基因的突变、染色质重塑相关基因和MEN1/DAXX/ATRX的突变是ALT激活过程伴随的重要分子事件。
第二部分:高MCM7增殖指数:早期胰腺神经内分泌肿瘤进展的有力预测指标
胰腺神经内分泌肿瘤(Pancreatic neuroendocrine neoplasms，PanNENs)有一个难以预测的临床过程，恶性潜能从惰性到高度恶性不等。目前尚无可靠的免疫组织化学标志物可用于PanNENs早期生物学行为的预测。微小染色体维持蛋白7(Minichromosome maintenance protein 7，MCM7)是细胞增殖的强有力的标志物。MCM7的表达是否与PanNENs的进展风险有关，目前仍不清楚。我们对156例PanNENs患者的分期、分级、Ki-67指数、MCM7指数等病理特征和临床行为进行了评估。较高的MCM7增殖指数与较大的肿瘤体积(P＜0.001)，无功能肿瘤(P＜0.001)，分级升高(P＜0.001)、TNM高分期(P＜0.001)显著相关。多因素分析中，G2/G3(危险比(hazardratio，HR)，2.21;95％置信区间(confidenceinterval，CI)，1.35-3.62;P＜0.001)，Ⅲ/Ⅳ期(HR2.11;95％置信区间，1.31-3.41;MCM7标记指数(labelingindex，LI)＞5％(HR，3.81;95％置信区间，1.30-11.17;P=0.02)为独立负向预后因素，与Ⅰ-Ⅳ期肿瘤进展风险相关。MCM7LI＞5％与Ⅰ-Ⅴ、Ⅰ-Ⅲ、和Ⅰ-Ⅱ期的肿瘤进展风险增加有关。我们的研究证实，MCM7是评估PanNENs的进展一个有价值的指标，尤其对于早期疾病和无远处转移的患者。