目的探索神经性因素在先天性肾盂输尿管连接处梗阻性肾积水发病中的作用以及先天性肾盂输尿管连接处梗阻性肾积水的发病的病因、病理基础。1.探讨正常情况下胎儿-新生儿肾盂输尿管连接处组织的神经纤维分布特点、病理基础。2.探讨在先天性肾盂输尿管连接处梗阻性肾积水中病变段组织的神经纤维分布特点作用以及变化和可能的作用。3.探讨神经纤维在先天性肾盂输尿管连接处梗阻性肾积水发病中的作用。方法1.实验分组将先天性肾盂输尿管连接处梗阻性肾积水患儿手术切除的肾盂输尿管连接处狭窄段设为实验组A组,共31例;同一患儿输尿管手术切缘设为对照组B组,共31例;产前排除泌尿系异常的32周以上引产或死亡并进行尸解的胎儿-新生儿共30例设为正常对照组C组;其中,胎儿共26例,新生儿尸解4例(标本的获取均符合本单位医学伦理委员会的要求)。2.标本的获取、制片标本获取后于10%甲醛溶液中固定24h,二甲苯透明,梯度酒精脱水,石蜡包埋,做3μm厚连续切片。3.HE染色各组样本在石蜡包埋切片后行常规HE染色,光镜下观察各组标本是否存在有神经节细胞。4.免疫组化检测标本中PGP9.5的表达按照EnVision System二步法分步骤进行免疫组化。棕褐色示PGP9.5免疫活性阳性部位。计数按照Weidner等的方法并加以改进:先在低倍视野内(100×)找到组织切片内神经纤维密度最高的区域,即“热点”,选取三个“热点”;然后在高倍视野内(200×)计数神经纤维的数目。分辨不清的不计入计数结果。计数由两名病理科主治以上医师采用双盲法分别对同一组织切片进行计数,取两者计数中较高数据作为该片的计数结果。结果用均数±标准误表示。5.电子显微镜下观察结果各随机从A、B组中选取10例,标本取得后在2分钟内立即投入戊二醛中行固定,树脂包埋,用特制的超薄切片机(ultramicrotome)切成超薄切片,再经醋酸铀和柠檬酸铅等进行电子染色,而后行电镜检查。电镜下观察神经纤维情况。评价两组间是否存在差异情况。结果1.HE染色三组样本:手术切除的肾盂输尿管连接处狭窄段(实验组A组)31例;同一患儿输尿管手术切缘(对照组B组)31例;产前排除泌尿系异常的32周以上引产或死亡并进行尸解的胎儿-新生儿(正常对照组C组)30例。高倍视野(×200倍)经观察,均未见明显神经节细胞。2.免疫组织化学检测对实验组A组、对照组B组、正常对照组C组三组共92个标本分别进行免疫组化检测,结果显示PGP9.5免疫阳性细胞主要分布神经纤维的胞浆中,很好的显示出神经纤维。在高倍视野内(200×)计数神经纤维的数目。计数由两名病理科主治以上医师采用双盲法分别对同一组织切片进行计数,取两者计数中较高数据作为该片的计数结果。结果用均数±标准误表示。通过数据统计分析神经纤维在各组中的分布以及数量差异情况。2.1 PGP9.5显色显示神经纤维在不同组间的分布差异本研究检测了实验组A组、对照组B组、正常对照组C组三组样本。通过免疫组化检测,显示神经纤维。分析其在各组间的分布差异。在所有的样本中,切面各层见神经纤维并非同向性排列,可见神经纤维的斜切面、纵切面、横断面。提示神经纤维的走向并非单纯的横向或者纵向。2.2 PGP9.5显色显示神经纤维在不同组间的数量差异各组样本通过免疫组化检测,显示神经纤维。高倍镜下进行计数。结果显示手术切除的肾盂输尿管连接处狭窄段A组神经纤维明显较同一输尿管手术切缘B组分布密度低。而且,在所有的A组样本中,显色的神经纤维均未出现在肌层,均处于肌层之外。而B、C组的神经纤维可见部分位于肌层中,提示该两处位置神经纤维自外膜延伸入肌层。Nemenyi法统计分析提示B-A组、C-A组的比较均有统计学差异(P<0.05);B-C组的比较无统计学差异(P>0.05)。3.电子显微镜下观察结果电子显微镜下图像定位于肌层以及肌层外系膜组织,A、B组于电子显微镜观察下提示两组之间神经纤维组织在形态上并无明显差异。其中大多数为无髓鞘神经纤维。结论本研究采用PGP9.5进行免疫组化检测。PGP 9.5 (蛋白基因产物9. 5)是一种神经元特异性蛋白,存在于中枢和外周神经系统的各个水平及神经内分泌细胞中,在胞浆和细胞核中表达。传统的HE染色很难辨别幼稚的神经丛组织结构。而PGP 9. 5的表达情况为:神经组织(不论年龄段)皆阳性,且幼稚肌间神经丛节细胞清晰;PGP 9. 5神经细胞胞浆胞核皆阳性,核大,核仁清晰,而在未成熟神经节细胞则染色更深,细胞核呈深棕色。1993年karahan实验表明:PGP9.5可以标记上尿路的神经元以及神经纤维的表达。另外,还包括:NSE、S100。在国外关于神经纤维的检测中,都证明PGP9.5是一种理想的手段。实验结果表明在患儿的输尿管段中,切缘较狭窄段神经纤维密度明显增多明显。并且,在狭窄段中的肌层中并未见明显神经纤维,同切缘比较有明显差异,提示神经纤维的发育分布差异情况。而同正常对照组比较同样存在明显异常。输尿管的发育是由输尿管芽的主干形成输尿管,其末端膨大并反复分支,形成肾盂、肾盏、乳头管和集合小管。目前先天性肾盂输尿管连接处梗阻性肾积水的具体发病机制尚未完全明确。通过实验对于其神经因素的研究,探讨可能的机制:神经嵴细胞沿输尿管芽发育的方向移行过程中发生停顿,导致输尿管芽末端即肾盂输尿管连接部神经细胞发育欠佳,进而影响输尿管肌层的发育以及运动控制,进一步导致该处出现狭窄、蠕动欠佳。