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目的:根据课题组前期的研究,我们通过细胞学实验证明提高miR-25-3p在食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)细胞系中的表达量后,细胞侵袭和增殖能力增强,说明miR-25-3p在ESCC的发生发展中可能具有重要的功能性调控作用。本研究希望通过生物信息学等技术筛选验证miR-25-3p调控机制,为进一步了解miR-25-3p在食管癌中的作用提供理论基础。方法:第一部分:在GEO数据库,搜索框输入检索关键词"esophageal squamous cell carcinoma",从检索结果中进行数据挖掘。将数据导入基于R语言设计的GEO2R芯片数据分析工具,得到ESCC细胞中差异性表达的m RNA集合;另一方面,使用Target Scan7.0靶基因预测软件预测miR-25-3p所有可能的具有高度保守性的靶基因列表,将上述得到的两列基因取交集,得到具有ESCC组织特异性高的miR-25-3p可能靶基因。将靶基因上传至DAVID基因功能注释软件进行富集分析,细胞功能富集选择GO数据库,通路富集选择KEGG数据库。通过文献及结果分析筛选所得靶基因。第二部分:脂质体包裹合成miRNA转染ESCC细胞系EC109,分为三组(1.增强组(miR-25-3p表达量增加),转染miR-25-3p agomir;2.抑制组(miR-25-3p表达量降低),转染miR-25-3p antagomir;3.对照组,转染空白序列)。荧光实时定量PCR(q RT-PCR)技术检测三组细胞NOTCH1表达量的变化。荧光素酶报告基因检测系统验证miR-25-3p与NOTCH1之间在3′非编码区(Untranslated Regions,UTR)的靶向位点。第三部分(miR-25-3p靶向NOTCH1对细胞增殖与侵袭功能的作用研究)课题组前期已经对miR-25-3p对EC109细胞增殖和侵袭能力的研究进行了研究,本次通过转染NOTCH1 si RNA沉默NOTCH1,模拟miR-25-3p调控NOTCH1,观察细胞功能,分为两组(1.沉默组(抑制NOTCH1基因表达),转染NOTCH1 si RNA;2.对照组,转染si-scrambled)。Transwell侵袭实验检测转染后细胞侵袭能力,CCK-8法检测细胞转染后细胞增殖能力。结果:通过Target Scan 7.0预测与miR-25-3p有高度保守结合位点的靶基因,共1037个。GEO2R中设置组别,KYSE30和KYSE180高移动能力细胞亚系设置为KYSE D组,亲本细胞设置为KYSE U组。通过GEO2R的一致性检验,8个样本间一致性较好,得到差异基因24491个,去掉miRNA及未录入Gene symbol数据库的基因ID,最终得到19491个差异基因。与上述预测的靶基因取交集,得到miR-25-3p可能在ESCC中参与调控的基因623个。KEGG筛选条件:P值<0.05且基因数>2个,基因主要富集于Fox O、c AMP、细胞骨架等信号通路;GO筛选条件:P值<0.05且基因数>2个,GO中与侵袭、增殖相关基因NOTCH1、PTEN、TGFB2等。结合既往文献、生物信息学功能分析,以及miR-25-3p与靶基因之间的负性调控机制,选择NOTCH1作为miR-25-3p的靶基因进行验证及细胞功能性实验。转染miR-25-3p后q RT-PCR检测结果显示增强组miR-25-3p的表达水平明显高于对照组(p<0.05),抑制剂组miR-25-3p的表达明显低于对照组(p<0.05),miR-25-3p在ESCC细胞系EC109中的高表达及低表达细胞模型构建成功。q RT-PCR检测转染后NOTCH1在各组的表达情况,增强组NOTCH1表达较对照组显著降低(p<0.05),抑制组NOTCH1表达较对照组升高(p<0.05)。荧光素酶报告基因检测系统显示miR-25-3p靶向NOTCH1 3′UTR互补位点,是荧光素酶活性较对照组明显降低(p<0.05),说明miR-25-3p与NOTCH1之间具有靶向调控关系。EC109细胞转染si-NOTCH1后,沉默组NOTCH1表达量较对照组明显降低,构建NOTCH1沉默细胞模型成功,Transwell侵袭实验结果显示沉默组细胞侵袭能力较对照组明显增强(p<0.05),CCK-8增殖实验结果显示沉默组细胞增殖能力较对照组明显增强,与miR-25-3p高表达细胞模型细胞功能学结果一致。结论:miR-25-3p可以通过靶向NOTCH1影响ESCC细胞系EC109的增殖和侵袭能力。