生物传感器由于其简便、快捷、灵敏、准确等特点在科学研究、疾病诊断、农业食品安全、环境污染物检测等领域展现出广阔的应用前景。例如,在污染物检测领域,一种可被成功应用的生物传感器首先应该具有高灵敏性,即能够对微量的待测污染物进行识别,并释放出易被定量的报告基因信号。在此需求下,新的技术手段,如对识别元件进行优化改造或者对报告基因信号进行放大等都可以被开发来弥补生物传感器灵敏度不足的缺陷。在本课题中,我们设计了一种将T7 RNA聚合酶表达系统和两级蛋白酶的级联激活相结合的策略来实现最终报告信号放大的系统,并计划与现存的污染物生物传感器联用,从而提高污染物检测的灵敏度。主要研究内容如下:（1）解析和优化了T7 lysozyme介导的T7 RNA聚合酶抑制系统。T7 lysozyme可通过与T7 RNA聚合酶相结合来抑制其活性,从而导致其调控的基因在大肠杆菌中无法被有效的转录和表达。然而由于T7 lysozyme对T7 RNA聚合酶活性的抑制不完全,这一系统会面临背景较高的问题。以sf GFP作为报告基因,我们优化了T7 lysozyme与T7RNA聚合酶之间柔性氨基酸linker的长度,发现相对于文献发表采用的28aa长度linker,32aa长度linker能使T7 lysozyme针对T7 RNA聚合酶的抑制效果更加充分,在18℃/30℃/37℃条件下分别诱导20 h/12 h/6 h后,系统荧光强度分别降低了91%/88%/76%左右。随后我们发现降低E.coli中表达质粒拷贝数并不能提高抑制效果,并且确定了0.05 m M IPTG为最适的诱导条件。（2）人鼻病毒3C蛋白酶（第一级）对T7 RNA聚合酶抑制系统的激活。有研究报道利用烟草花叶病毒（TEV）蛋白酶对T7 lysozyme与T7 RNA聚合酶之间的linker序列进行切割,可以解除T7 lysozyme对T7 RNA聚合酶的抑制。考虑到人鼻病毒（HRV）3C蛋白酶相对而言具有更高活性及更强的低温适应性,我们将两种蛋白酶的底物序列都分别置于T7 lysozyme和T7 RNA聚合酶之间的柔性Linker中,并对比测试了导入两种蛋白酶后T7 RNA聚合酶抑制系统中sf GFP的荧光恢复效率。实验结果表明,HRV3C蛋白酶比TEV蛋白酶能更有效的解除T7 lysozyme对T7 RNA聚合酶的抑制;并且,HRV 3C蛋白酶在广泛的温度条件下都具有较好的切割活性,在18℃/30℃/37℃条件下分别诱导激活20 h/12 h/4 h后,T7 RNA聚合酶抑制系统中sf GFP的相对荧光比例分别提高了29%/42%/43%。（3）建立蛋白酶级联放大体系。首先抑制HRV 3C蛋白酶（第一级）的活性,然后通过诱导表达另一个蛋白酶（第二级）来激活HRV 3C蛋白酶,使其进一步激活T7lysozyme介导的T7 RNA聚合酶抑制系统,最终可以获得经过多次放大的高效信号。1)第一级HRV 3C蛋白酶的抑制。我们在HRV 3C蛋白酶的羧基端引入了Ssr A降解标签,可以引导它被大肠杆菌内源的Clp X/P蛋白酶体系统降解,从而丧失激活T7 RNA聚合酶抑制系统的能力,T7 RNA聚合酶调控的sf GFP荧光也因此被降低到被抑制水平。2)蛋白酶级联放大体系中第二级蛋白酶的选择。我们首先测试了TEV蛋白酶作为第二级蛋白酶去除HRV 3C蛋白酶羧基端Ssr A降解标签来激活系统荧光的可能性。我们的初步实验结果发现,这个蛋白酶级联放大体系可以恢复系统荧光的14%左右。目前,我们也正在尝试使用HRV 3C蛋白酶突变体或者口蹄疫病毒（FDMV）3C蛋白酶等作为第二级蛋白酶来优化这一体系。（4）T7 RNA聚合酶和蛋白酶级联激活介导的污染物生物传感器的构建。我们测试了将来源于恶臭假单胞菌的萘生物传感器与T7 RNA聚合酶和蛋白酶级联激活介导的信号放大体系进行联用,特别是与蛋白酶级联放大体系的联用。我们初步尝试了利用TEV蛋白酶作为第二级蛋白酶的效果（Nah R-Psal-TEVp）,然而由于萘生物传感器在大肠杆菌中的有效性待确认、TEV蛋白酶的活性不够高、Ssr A标签降解HRV 3C蛋白酶能力较强等原因,目前并没有能通过萘生物传感器有效激活T7 RNA聚合酶抑制系统中的荧光。综上所述,我们设计了一种基于T7 RNA聚合酶和蛋白酶级联激活的信号放大的系统,理论上该系统与现存的生物传感器连接后可用于扩大反应信号,提高灵敏度,同时有望为其他类型的体内反应的信号放大提高重要参考。