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研究背景:弥漫大B细胞淋巴瘤（Diffuse large B cell lymphoma,DLBCL）是最常见的血液系统恶性肿瘤,全球每年发病超过100000例。尽管近年来DLBCL的诊断和治疗有了较大的进步,但仍有高达30%的患者死于该疾病。目前DLBCL的发生机制尚不完全清楚,因此有必要寻找在肿瘤发生、发展中起关键作用的核心基因和信号通路,进一步揭示DLBCL的分子机制,为其治疗提供指导。吲哚胺2,3-双加氧酶1（indoleamine 2,3-dioxygenase 1,IDO1）是体内色氨酸代谢的限速酶,能够催化色氨酸沿着犬尿氨酸途径分解代谢,主要代谢产物为犬尿氨酸。经典观点认为IDO1的免疫抑制作用是由色氨酸耗竭和犬尿氨酸累积导致的,它们通过激活调节性T细胞和树突状细胞,抑制效应T和自然杀伤细胞的功能发挥免疫抑制作用。IDO1在包括DLBCL在内的多种肿瘤中高表达且与预后差相关,然而,IDO1表达水平与DLBCL患者预后的关系目前仍存在争议。此外,IDO1对DLBCL细胞生长的影响及分子机制尚不清楚。目前关于IDO1在免疫耐受中的作用及机制已经研究的较为充分。近年来,越来越多的研究者开始关注IDO1不依赖免疫耐受的促进肿瘤发生发展的作用及机制。最近有研究报道IDO1抑制剂1-L-MT通过抑制CDC20的转录诱导HCT116和HT-29结肠癌细胞有丝分裂死亡,抑制肿瘤细胞增殖并导致细胞周期阻滞于G2/M期。但是,目前尚未发现关于IDO1在DLBCL中的不依赖免疫耐受的促肿瘤的作用及机制研究。前期我们对IDO1敲降组和对照组OCI-Ly10细胞进行RNA-Seq,发现IDO1敲降组细胞MDM2表达下调,TP53表达上调。我们既往的生信研究发现细胞分裂周期蛋白20（Cell division cycle 20,CDC20）在DLBCL中过表达并与不良预后相关。既往有研究报道p53作为转录因子结合到CDC20的启动子区并负调控CDC20的表达。鉴于此,我们推测CDC20可能是MDM2-p53信号通路的下游分子,提出了一条新的不依赖免疫耐受的MDM2-p53-CDC20通路。我们推测IDO1可能通过MDM2-p53-CDC20通路影响DLBCL细胞的生长。研究目的:本课题主要研究IDO1在DLBCL中的表达和临床意义,以及IDO1对DLBCL细胞生长的影响;并进一步探讨通过RNA-Seq筛选得到的IDO1下游信号通路MDM2-p53-CDC20对于DLBCL细胞功能的影响,并对其机制进行研究,为IDO1抑制剂应用于DLBCL提供必要的理论依据。研究方法:1)生物信息学方法分析GEO和TCGA中弥漫大B细胞淋巴瘤的IDO1表达情况;免疫组化检测弥漫大B细胞淋巴瘤组织中IDO1的表达,分析IDO1表达水平与临床病理特征和生存之间的关系。2)通过RNA-Seq,筛选MDM2-p53为IDO1下游通路,使用RT-q PCR验证测序结果;应用IDO1或MDM2抑制剂处理DLBCL细胞,通过蛋白免疫印迹法验证IDO1-MDM2-p53信号通路的调控关系;通过CCK8实验、Ed U增殖实验、细胞周期实验和细胞凋亡实验,验证IDO1对弥漫大B细胞淋巴瘤细胞生长的影响。3)通过构建NOD/SCID小鼠移植瘤模型,验证IDO1对弥漫大B细胞淋巴瘤肿瘤生长的影响。4)分析弥漫大B细胞淋巴瘤生物信息学数据库,并查阅文献筛选CDC20作为p53下游靶基因,通过蛋白免疫印迹法验证IDO1-MDM2-p53-CDC20信号通路的调控关系;分析CDC20表达水平与临床病理特征和生存之间的关系;通过细胞增殖实验、细胞周期实验和细胞凋亡实验验证CDC20对弥漫大B细胞淋巴瘤增殖、凋亡及周期的影响。研究结果:1)与对照组相比,IDO1在弥漫大B细胞淋巴瘤组织中显著高表达;IDO1表达程度与弥漫大B细胞淋巴瘤患者的Ann Arbor分期和IPI评分显著相关;IDO1高表达的患者比低表达患者预后明显较差。2)细胞功能实验显示,抑制IDO1表达能够抑制弥漫大B细胞淋巴瘤细胞增殖,促进细胞凋亡并导致细胞周期阻滞于G2/M期;免疫缺陷鼠移植瘤模型显示抑制IDO1表达能够在动物水平抑制弥漫大B细胞淋巴瘤生长。3)转录组测序结合生物信息学分析提示MDM2-p53-CDC20为IDO1下游通路;RT-q PCR验证了转录组测序的结果;MDM2和CDC20在弥漫大B细胞淋巴瘤中表达水平升高;CDC20能够促进肿瘤细胞增殖并抑制细胞凋亡。4)蛋白免疫印迹实验显示,抑制弥漫大B细胞淋巴瘤细胞内IDO1水平,MDM2和CDC20的表达受抑制,而p53表达升高;应用MDM2抑制剂处理细胞后,p53表达升高,CDC20表达水平降低;抑制CDC20的表达则对IDO1,MDM2和p53的表达无明显影响。研究结论:1)IDO1和CDC20在弥漫大B细胞淋巴瘤中高表达且与弥漫大B细胞淋巴瘤患者的不良预后显著相关。2)抑制IDO1表达可以抑制弥漫大B细胞淋巴瘤细胞增殖,促进细胞凋亡并导致G2/M期阻滞。3)在弥漫大B细胞淋巴瘤中,IDO1通过MDM2-P53-CDC20通路影响弥漫大B细胞淋巴瘤细胞的生长。