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白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)是Okamura等(1995)从小鼠肝脏中克隆获得的。Nakamori等(2003)研究发现,IL-18在抗肿瘤、抗感染及免疫调节等方面有着重要的作用,具有免疫治疗及免疫佐剂的作用,有潜在的应用前景。同时,随着奶牛业的发展,奶牛病特别是奶牛乳腺炎呈上升趋势,迫切需要新型疫苗与疫苗佐剂的研发。鉴于此,本实验室对牛白介素18(bovine interleukin-18,BoIL-18)进行了克隆表达,旨在探索利用BoIL-18能促进机体免疫功能的特性,将其应用于奶牛病的预防及临床治疗。本试验针对如何获得高效表达且具有生物学活性的BoIL-18蛋白及利用表达的蛋白如何制备BoIL-18单克隆抗体这些问题进行了探讨,主要包括以下四部分:第一部分:牛IL-18成熟蛋白基因的原核表达及生物学活性测定。根据已发表序列,设计一对特异性引物,将编码BoIL-18的成熟蛋白基因从重组质粒pMDT-BoIL-18中进行PCR扩增,然后亚克隆到原核表达载体pGEX6p-1中,转化至大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)BL21(DE3)感受态细胞中获得重组菌株,将该重组菌在IPTG的诱导下进行表达,用SDS-PAGE、Western blot分析表达情况;用谷胱甘肽琼脂糖(GST)亲和层析树脂对表达产物进行纯化,分析纯化产物的生物学活性。结果表明,BoIL-18重组菌经0.3mmol/L IPTG诱导8h,SDS-PAGE电泳分析获得了一条表达条带,分子量约为44KD,凝胶薄层扫描分析显示,表达的蛋白占工程菌菌体总蛋白的31.8%;生物学活性测定表明,BoIL-18融合蛋白浓度大于0.10mg/L时,对外周血单个核细胞(PBMC)有明显的增殖作用;BoIL-18融合蛋白浓度大于0.20 mg/L时,能诱导牛脾淋巴细胞产生IFN-γ,且随着BoIL-18浓度的增加,对IFN-γ的诱生作用增强;BoIL-18融合蛋白诱导脾淋巴细胞产生的IFN-γ有抑制水泡性口炎病毒(VSV)产生细胞病变的作用,且随IFN-γ产生量的增加,对VSV病毒的抑制作用增加。第二部分:牛IL-18成熟蛋白基因在昆虫杆状病毒表达载体中的表达及生物学活性测定。根据已发表序列,设计一对特异性引物,将编码BoIL-18的成熟蛋白基因从重组质粒pMDT-BoIL-18中进行PCR扩增,然后亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBac HTb中,构建重组转移载体质粒pFastBac HTb-BoIL18,将其转化至DH10Bac感受态细胞中得到重组Bacmid(Bacmid-BoIL18)。在转染试剂Cellfectin的作用下,将Bacmid-BoIL18转染至草地贪夜蛾细胞(Spodoptera frugiperda 9,sf9)获得重组杆状病毒,然后将重组杆状病毒感染sf9,感染后在不同时间收获sf9细胞及培养上清,应用SDS-PAGE电泳、Western blot分析表达情况;用Ni-NTA树脂对表达产物进行纯化,分析纯化产物的生物学活性。结果表明,BoIL-18成熟蛋白基因在昆虫细胞sf9中获得了表达,表达的目的条带分子量为26KD,经薄层凝胶扫描分析证实,表达量占总蛋白的21.3%;生物学活性分析表明,BoIL-18蛋白浓度大于0.05 mg/L时,具有明显加强PBMC的增殖的作用;当其浓度大于0.10 mg/L时,能诱导牛脾淋巴细胞产生IFN-γ,并且随着BoIL-18蛋白浓度的增加,诱导产生IFN-γ的量随之增加;通过诱导牛脾细胞产生IFN-γ,间接地抑制VSV产生细胞病变,且随IFN-γ产生量的增加,对VSV病毒的抑制作用增加。第三部分:BoIL-18单克隆抗体的制备。本试验将第一部分中获得的BoIL-18的原核表达产物作为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾与骨髓瘤细胞sp2/0在PEG的作用下进行融合;将第二部分中获得的BoIL-18在昆虫细胞sf9中的表达产物作为筛选抗原,利用间接ELISA方法反复筛选,应用有限稀释法进行多次克隆化后,最终获得了两株可分泌BoIL-18单克隆抗体的阳性细胞克隆。Western-blot证实,获得的单克隆抗体具有良好的特异性;间接ELISA试验检测单克隆抗体5G8和7B3的效价分别为1×105和1×106。对已经冻存的杂交瘤细胞株分别在第3月复苏,用间接ELISA检测杂交瘤细胞株的抗体效价不变,表明所获得的杂交瘤细胞株具有良好的稳定性。两株细胞克隆亚类均为IgG l。第四部分:牛IL-18成熟蛋白基因在家蚕幼虫中的表达。设计一对特异性引物,将编码BoIL-18的成熟蛋白基因从重组质粒pET-BoIL-18中进行PCR扩增,然后将其亚克隆至转移载体pVL1393中,在转染试剂Lipofectin的作用下,与线性化的病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕细胞Bm5,用蓝白斑法筛选出重组病毒BmBacPAK-BoIL-18,经PCR鉴定正确后将重组病毒接种至5龄家蚕幼虫体内,饲养一段时间,取家蚕血淋巴进行SDS-PAGE电泳分析与Western blot印迹测定,分析表达情况。结果表明,BoIL-18在家蚕幼虫体内成功地获得了表达,经凝胶薄层扫描分析显示,表达的目的条带占蚕血淋巴总蛋白的16.7%,Western blot分析证明,在相对分子质量(Mr)为18 000处有一特异性表达条带。