第一部分 多西环素对宫颈癌细胞增殖、凋亡和代谢的影响研究背景:宫颈癌是属于一种发生率很高的恶性肿瘤,其对患者的身心健康有很大威胁,全球每年由于这种疾病而死亡的女性超过三十万。目前宫颈癌的发病人群年龄有不断降低的趋势。早期宫颈癌患者通过手术治疗可明显改善临床预后。但是对于中晚期宫颈癌患者,放疗不敏感以及药物耐受严重影响患者结局,因此对于宫颈癌具体发病机制及其靶向药物的研究极为重要。独立地或与目前临床可用的化疗药物相结合的新的治疗策略的研发,是目前宫颈癌研究的热点之一。新型药物的研发是一个漫长而艰苦的过程,已有药物的重新定位却可以绕过这一过程,并使得基于假设的实验研究快速转化为临床治疗。有研究显示,应用抗生素治疗是一种很有前景的治疗恶性肿瘤的新措施。FDA批准的替加环素(Tigecycline),可定向的杀死急性髓系白血病(AML)干细胞,阿奇霉素,可以抑制多种肿瘤类型包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和肺癌等的肿瘤球形成能力。多西环素也被称作为脱氧土霉素,是1967年由FDA批准的一种抗生素,主要用于治疗支原体、衣原体等感染。近年来,临床医学和生物医学研究发现多西环素除抗菌作用以外,还存在可被应用在诱导基因表达的潜在混杂效应。研究发现这些药物达到一定浓度时可以改变基因的表达模式,并显著改变细胞的代谢状况,降低细胞的增殖速率。一些研究已经证明了多西环素可以影响线粒体的生物生成和细胞新陈代谢。由于FDA批准的抗生素的副作用在临床上是可控的,因此,可以将这些抗生素重新定位,作为一种相对无毒的方法靶向杀灭肿瘤细胞,可以为治疗恶性肿瘤提供新方法。研究目的:利用细胞模型实验和动物模型实验研究多西环素对宫颈癌细胞增殖、凋亡、细胞代谢等生物学方面的影响。研究方法:1.MTS细胞增殖实验:检测6种宫颈癌细胞系,包括2种HPV18阳性的细胞系(HeLa和CaLo细胞系),2种HPV16阳性的细胞系(SiHa和CaSki细胞系),2种HPV阴性的细胞系(ViBo和C-33A细胞系)分别用5μM、10μM、20μM、40μM浓度的多西环素处理72小时后,细胞在490nm波长下的光吸收值,定量分析多西环素对宫颈癌细胞增殖的影响。2.Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡实验:分别用5μM、10μM、20μM、40μM浓度的多西环素处理6种宫颈癌细胞系72小时后,收集细胞用Annexin V-FITC/PI进行双染,且据此检测这种药物引发宫颈癌细胞凋亡的效果。用40μμM浓度的多西环素处理细胞24小时、48小时、72小时后,检测多西环素处理不同时长对宫颈癌细胞凋亡的影响。3.检测细胞耗氧率、细胞外酸化率及ATP水平:对6种宫颈癌细胞系以40μM浓度的多西环素处理不同时间后,分别检测24小时、48小时和72小时的细胞耗氧率、细胞外酸化率及ATP水平变化。4.Western Blot:40μM浓度的多西环素处理HeLa细胞24小时后,提取蛋白,用Western Blot方法检测cleaved-Caspase-3的蛋白水平变化,β-actin为内参。5.小鼠异种移植实验:由于实验周期及经费所限,本部分选取HeLa细胞建立动物实验模型。在免疫缺陷鼠皮下注射5×106 HeLa细胞,待肿瘤体积达到200mm3时,开始腹腔注射100mg/kg的多西环素或安慰剂,每日2次;每隔一日检测肿瘤,确定出其最大径与最小径,然后计算出肿瘤体积;建立起给药两周时的肿瘤生长曲线。通过免疫荧光方法,采用PCNA标记增殖,TUNEL检测细胞凋亡情况。研究结果:1.多西环素对宫颈癌细胞增殖的影响:不同浓度的多西环素处理72小时后,宫颈癌细胞增殖能力随着多西环素浓度的不断增加逐渐降低,10μM多西环素处理组细胞增殖能力降至70%-50%,40μM处理组增殖能力降至10%至零,差异有统计学意义。2.多西环素对宫颈癌细胞凋亡的影响:随着多西环素浓度的不断增加,宫颈癌细胞凋亡逐渐增多;并且随多西环素处理时间的延长,凋亡比例呈现逐渐上升的趋势,40μM多西环素处理宫颈癌细胞24小时及48小时后,凋亡比例由20%-45%上升至40%-60%,处理72小时凋亡比例达到60%-70%;差异有统计学意义。3.多西环素对宫颈癌细胞代谢的影响:40μM多西环素处理细胞24、48和72小时后,细胞耗氧率分别下降至40%、20%、10%,(P<0.01);ATP水平分别下降至55%、20%、10%,(P<0.01);细胞外酸化率呈现先上升后下降的趋势;差异均有统计学意义。4.多西环素对Caspase-3表达的影响:与对照组相比,多西环素能明显提高HeLa细胞中cleaved-Caspase-3的蛋白水平;加入Caspase的特异抑制剂Z-VAD-FMK后使细胞凋亡明显减少,与加药组相比差别有统计学意义。5.多西环素对SCID小鼠体内宫颈癌细胞生长的影响:多西环素治疗过程中,没有观察到任何有细胞毒性、体重下降、行为异常或其他临床症状的迹象。两周后,治疗组与对照组的平均肿瘤体积分别为490± 1 90mm3和910±170mm3,差异有统计学意义(P<0.01);且免疫荧光镜下显示多西环素治疗组细胞增殖减少而细胞凋亡增多。结论:1.多西环素在体外环境下可有效的阻碍宫颈癌细胞生长,存在剂量依赖性;且引发这种细胞凋亡的凋亡效果与剂量、时间密切相关。2.多西环素影响宫颈癌细胞能量代谢,能够降低宫颈癌细胞的ATP水平,显著抑制细胞耗氧率、细胞外酸化率,存在时间依赖性。3.其可基于半胱天冬酶途径促使这种癌细胞凋亡。4.在HeLa细胞异种移植小鼠模型中,多西环素可以显著抑制肿瘤生长。综上,本部分实验研究证实了多西环素在体外和体内均可以有效地靶标宫颈癌细胞。结合细胞模型实验及动物模型实验,多西环素可能可以被重新定位并用于治疗宫颈癌,并且靶向能量代谢可能会成为宫颈癌治疗的一种潜在策略。第二部分 多西环素干预下HeLa细胞转录组基因测序及生物信息学分析研究背景:二代测序技术(NGS)又称为高通量测序(HTS)技术。这种技术开启了人类对于基因研究的全新时代。基于二代测序技术的转录组测序分析即RNA seq,可快速全面的获得研究目的细胞(或组织)在某一特定条件下的几乎全部转录组信息,进行基因表达定量、基因差异显著性统计、基因功能和结构、以及新转录本预测等的研究。RNAseq以其检测范围广且灵敏度高的独特优势,在转录组学研究中开始受到关注,广泛应用于生命科学的各个领域,成为目前深入研究转录组的强大应用工具。同时将这种技术和基于计算机软件的生物信息学技术结合起来,逐渐形成了利用已获得的数据信息挖掘生命科学中蕴含的重要资源,通过分析数据建立假设并实验验证,进而解决目前生物医学问题的新型生物学研究模式。遗传相关的基因组和蛋白组间可通过转录组高效的结合起来,不过关于转录组学还存在着许多未知的领域,尚有很大的探索空间。近些年,在HTS技术急速发展与测序成本减少下,转录组基因测序因其高灵敏度、较广的检测范围,以及可以提供全面的转录组信息等独特的优势对于转录组学研究领域的重要性日益凸显,在生命科学研究领域的应用日益广泛。主要如疾病机制、基因表达调控等,成为目前深入研究转录组的强大应用工具,同时随之建立起依托当前既有数据信息,先开展理论推测,接着开展实验验证的创新型生物学研究模式。转录组学在不断的改进后已经很成熟,成为生物信息学研究领域应用广泛的研究技术。本组前期研究证实多西环素在体外和体内对宫颈癌细胞的增殖具有抑制作用,且基于半胱天冬酶诱导宫颈癌细胞凋亡。同时,影响宫颈癌细胞能量代谢,以一种时间依赖的方式降低宫颈癌细胞的ATP水平、耗氧率及细胞外酸化率。但目前国内外对于多西环素通过半胱天冬酶途径诱导宫颈癌细胞凋亡的具体机制并不十分清晰。本研究拟通过转录组测序、差异基因表达分析、KEGG通路富集、基因筛选等方法探讨多西环素依赖半胱天冬酶途径诱导宫颈癌细胞凋亡的机理,所得结果为此领域的研究提供借鉴,也为宫颈癌治疗中这种药物的应用提供参考。研究目的:探索多西环素依赖半胱天冬酶途径诱导宫颈癌细胞凋亡的作用机制研究方法:1.选取宫颈癌HeLa细胞作为研究对象,设立溶剂组(N),多西环素组(DOX),多西环素+Caspase抑制剂(Z-VAD-FMK)组(C3_DOX),每个组别分别设立三个重复组。DOX组给予4(μM浓度多西环素处理72小时,C3_DOX组给予40μM浓度多西环素处理72小时后,加入10μM的Caspase抑制剂Z-VAD-FMK 处理 20min。2.转录组测序:分别对三个组别的9组HeLa细胞进行RNA提取与检测、文库构建与质检、上机测序(Illumina),得到数据后对数据产量进行统计与质量评价,应用String Tie软件进行新转录本组装并完成数据注释。3.使用subread软件中的feature Counts工具,定量检测了基因表达水平,而基因表达水平的异同则基于DESeq2工具来分析。4.对差异基因集进行GO、KEGG富集分析。5.根据筛选出多西环素组对比溶剂组中上调的基因且同时多西环素+Caspase抑制剂组对比多西环素组中下调的基因,以及多西环素组对比溶剂组中下调的基因且同时多西环素+Caspase抑制剂组对比多西环素组中上调的基因,两部分取并集进行基于IPA的经典通路分析。研究结果:1.将转录组测序所获得的原始数据进行一定测序错误率检查、GC含量分布检查后,为其后的富集分析提供支持。多西环素组、多西环素+Caspase抑制剂组以及溶剂组的三个平行重复均获得6.0G以上的clean reads,GC含量比在50%左右。2.基因差异表达:多西环素组对比溶剂组获得5838个差异表达显著基因,上调和下调表达基因分别为2947、2891个;多西环素+Caspase抑制剂组对比溶剂组获得5819(上调2939,下调2880)个表达差异显著基因;多西环素+Caspase抑制剂组对比多西环素组获得1963(上调751,下调1212)个差异表达显著基因;P<0.05以及|log2foldchange|>0.0作为显著差异表达的阈值。3.对差异表达显著基因进行GO功能富集分析:多西环素组对比溶剂组、多西环素+Caspase抑制剂组对比溶剂组的差异表达基因集中在细胞凋亡信号通路、核糖核蛋白复合物(RNP)生物合成、细胞凋亡的调控等生物学过程;多西环素+Caspase抑制剂组对比多西环素组差异表达基因主要与细胞黏附、细胞连接等分子功能以及RNP生物合成相关。4.对这些基因开展KEGG通路富集分析:溶剂组、多西环素及多西环素+Caspase抑制剂组两两比较的差异表达基因主要富集在内质网中蛋白质的生物生成的相关通路中,表达差异明显。5.IPA经典通路研究发现EIF2信号通路被激活。研究结论:1.多西环素及多西环素+Caspase抑制剂干预后与溶剂组相比较,差异基因表达显著;多西环素在诱导基因表达系统中发挥作用,可以一定的药物浓度改变基因的表达模式。2.GO及KEGG富集分析结果提示多西环素可以通过影响HeLa细胞内质网中蛋白质的生物生成过程,影响细胞能量代谢,诱导细胞凋亡。3.IPA分析提示多西环素可能通过激活EIF2 Signaling通路,诱导HeLa细胞依赖半胱天冬酶途径发生凋亡。综上,本部分研究提示多西环素可通过改变HeLa细胞内质网基因蛋白的表达而改变HeLa细胞的代谢状况;并且多西环素诱导HeLa细胞通过半胱天冬酶途径发生的细胞凋亡,可能是经由激活EIF2 Signaling通路所介导。第三部分 PERK-eIF2α-ATF4信号通路介导多西环素诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡研究背景:内质网是维持真核细胞内环境稳定的重要膜细胞器,细胞内外的诸多不良刺激,如缺血缺氧营养缺乏状态、细胞异常的快速增殖、葡萄糖代谢障碍以及蛋白质合成异常、病毒感染等因素的影响下,细胞内质网的结构和功能都可能产生变化,而使得内质网中聚集大量没有正确折叠的蛋白质,而严重影响了其功能,导致内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)。研究表明除凋亡小体及线粒体途径以外,ERS也可介导细胞凋亡,与肿瘤的发生以及发展密切相关。内质网应激后,细胞为维持内环境的稳定,启动未折叠蛋白反应UPR而应对这种应激带来的影响。GRP78属于一种重要的应激蛋白,在ERS发生早期表达增高,对蛋白质的正确折叠有一定促进作用,同时也使钙离子恢复正常转运,在此基础上确保内质网稳态,也为细胞功能的维持提供支持;在内质网应激反应很强情况下,GRP78与PERK解离,UPR启动其分支PERK-elF2α通路,将抑制整体的蛋白质合成并激活ATF4的选择性翻译,CHOP作为ATF4的靶蛋白呈现表达增高,促使细胞色素C大量的释放,而引发Caspase凋亡程序,且进而促使细胞凋亡。本组前期研究已证实多西环素在体外和体内环境下都可靶向的抑制宫颈癌细胞,诱导凋亡并可通过改变基因的表达模式而改变细胞的代谢状况,降低细胞耗氧率及ATP水平;生信分析提示多西环素对HeLa细胞代谢的影响主要集中体现在影响内质网内的蛋白质生物生成,并激活EIF2信号通路,同时还基于半胱天冬酶途径而促使这种细胞凋亡。研究目的:探究多西环素干预下PERK-eIF2α-ATF4信号通路在宫颈癌HeLa细胞中的作用机制。研究方法:1.RT-qPCR:选取宫颈癌HeLa细胞为研究对象,多西环素组(DOX)给予40μM多西环素处理72小时,多西环素+Caspase抑制剂(Z-VAD-FMK)组(C3_DOX)40μM浓度多西环素处理72小时后,加入10μM的Caspase抑制剂Z-VAD-FMK处理20min,设立溶剂组(N),每个组别分别设立三个重复组。采用实时定量PCR实验检测,对不同处理方法的HeLa细胞中蛋白分子GRP78、eIF2α、PERK、ATF4、CHOP的基因转录水平进行定量分析。2.Western blot:采用蛋白免疫印迹法对上述多西环素组、多西环素+Caspase抑制剂组及溶剂组的这种癌细胞内GRP78、eIF2α、PERK、ATF4、CHOP的蛋白表达水平进行定量分析。研究结果:1.多西环素增加HSPA5基因的转录水平以及其对应编码蛋白GRP78/Bip的蛋白表达水平。多西环素组及多西环素+抑制剂组HSPA5基因表达丰度分别为溶剂组的2.031倍和1.284倍(p<0.01)。GRP78的蛋白表达水平亦较溶剂组增加。2.多西环素增加EIF2AK3、EIF2S1的转录水平,基因表达丰度分别为溶剂组的1.629倍和1.224倍(p<0.01);PERK及eIF2α蛋白表达水平未呈现增加趋势。3.多西环素明显增加ATF4的基因表达水平及蛋白表达水平。多西环素组及多西环素+抑制剂组ATF4基因表达丰度分别为溶剂组的1.901倍和2.015倍(p<0.01);多西环素组中ATF4的蛋白表达水平较溶剂组增加。4.多西环素明显增加CHOP的基因表达水平及蛋白表达水平。多西环素组及多西环素+抑制剂组DDIT3基因表达丰度分为溶剂组的5.407倍和6.339倍(p<0.01);和溶剂组相比两加药组中CHOP水平显著增加。研究结论:1.多西环素诱导HeLa细胞出现ERS反应。2.内质网应激相关EIF2 Signaling通路被激活。3.PERK-eIF2α-ATF4通路介导多西环素诱导的HeLa细胞凋亡。综上,本研究证实多西环素触发HeLa细胞发生内质网应激反应,激活EIF2 Signaling通路,上调内质网应激相关蛋白GRP78、eIF2α、PERK、ATF4、CHOP,影响内质网内的蛋白质生物生成等过程,从而触发Caspase级联反应,导致细胞凋亡。即多西环素诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡是通过PERK-eIF2α-ATF4信号通路发挥作用的。