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腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth disease,CMT)是最常见的遗传性周围神经病之一,发病率大约4/10000。CMT临床表现具有高度异质性,致病基因种类繁多,目前有超过80种基因被报道与该病有关,且致病基因突变类型复杂多样,包括大片段重复、缺失,点突变等,这给CMT的临床、基因诊断带来巨大挑战。因此,建立系统、简便有效的基因诊断流程非常必要。本研究首先采用多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)对所有临床诊断为CMT的病人进行筛查,然后对MLPA检测结果阴性的病人进行靶向二代测序(Targeted Next-Generation Sequencing,Targeted NGS)对检出的变异进行生物信息学及家系共分离分析,并采用美国医学遗传学和基因组学学会指南(American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)判断其致病性质,对部分致病性质判定不明确的变异进行行体外细胞功能研究。此外,由于GJB1基因调控区突变并不少见,而靶向二代测序未覆盖到此区域,因此我们设计了引物对GJB1基因全长包含调控区进行Sanger测序。本研究建立了系统的CMT基因筛查诊断流程,描述了中国东南地区CMT患者基因型分布情况,分析了CMT患者基因型和表型的关联性,并对发现的GDAP1基因新变异位点进行功能研究,初步探讨其导致CMT可能的发病机制。第一部分腓骨肌萎缩症致病基因变异筛查及基因型表型分析目的:应用MLPA及靶向二代测序对CMT患者进行致病基因筛查,评估靶向测序在CMT诊断中的应用,并描述中国东南地区CMT患者基因型分布特点,分析基因型表型之间的关系。方法:总共招募152例临床诊断为CMT的先证者,首先采用MLPA技术对所有病人进行筛查,然后将MLPA检测结果阴性的病人进行靶向二代测序,对得到的结果进行生物信息学及家系共分离分析,并采用ACMG指南对新变异位点进行致病性评估。结果:通过MLPA分析我们共检出52例患者存在PMP22拷贝数变异,其中40例为PMP22重复突变,12例为PMP22缺失突变。剩余的100例患者经靶向二代测序检测后,56例患者找到CMT相关基因变异,3例患者经Sanger测序检出GJB1调控区突变(c.-103C>T)。剩下的41例患者未发现明确致病基因变异。靶向二代测序结合MLPA诊断阳性率约73.0%(111/152)。在140例CMT患者中,PMP22重复突变最常见,占28.6%(40/140),其次为GJB1,占13.6%(19/140),MFN2也较为常见,占7.1%(10/140)。通过基因型与表型关系分析,我们发现中国东南地区CMT患者基因型分布与既往国外报道结果类似,PMP22重复突变患者起病年龄相对较晚,中间型CMT占比较大,NDRG1突变频率相对较高。结论:MLPA结合靶向二代测序能实现CMT病人致病基因快速筛查,提高CMT患者确诊率。本研究发现了22个CMT相关基因的新变异位点,拓宽了CMT基因突变谱;进一步总结了中国东南地区CMT患者的临床特点及基因型分布特点,为CMT的精准诊断提供了借鉴。第二部分GDAP1基因新变异位点的功能研究目的:我们在4个CMT家系中发现6个GDAP1基因变异位点,其中3个为新变异位点(p.L26R,p.S169fs和c.490+1G>A)。本研究拟运用体外细胞功能实验对新变异位点的致病性进行研究并从突变入手初步探讨其致病机制。方法:取得患者知情同意后,通过肌肉组织活检术及电镜技术,观察患者肌肉组织中线粒体结构;通过皮肤活检术,构建原代皮肤成纤维细胞模型,利用免疫印迹实验及激光共聚焦显微镜检测突变对线粒体动力学及Gdap1蛋白表达的影响,利用荧光素酶检测法检测突变对细胞ATP产生的的影响,利用Mini Gene试验验证突变对剪切功能的影响。结果:p.L26R和p.S169fs突变可影响线粒体结构,使线粒体网络分布发生异常,蛋白表达明显降低,线粒体ATP产量下降,下调线粒体动力相关蛋白(dynamin-related protein 1,Drp1)表达。c.490+1G>A突变可影响正常剪切功能,导致GDAP1基因5号外显子跳跃。结论:本研究运用体外功能实验证实GDAP1新变异位点的致病性,扩展了GDAP1基因致病突变谱,并初步探讨了GDAP1突变对线粒体功能的影响。