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原发性肝癌(简称肝癌)是人类最常见的恶性肿瘤之一,因其恶性程度高、预后差被称为“癌中之王”。如今,全世界50％以上的新发和死亡肝癌患者发生在我国,每年我国大约有30万人因患肝癌死亡。随着人们对肿瘤微环境研究的深入,认为肿瘤是在肿瘤细胞与其周围所处的微环境共同作用下形成的,不再只局限于恶变的细胞上。肿瘤微环境是肿瘤在发生发展过程中所处的内环境.包括肿瘤细胞本身、基(间)质细胞、微血管及少量的浸润细胞[1]。其中与肿瘤生成与发展的微环境最直接相关的是基质细胞。基质细胞作为肿瘤微环境中的重要组成部分,在肿瘤的发生发展过程中起着重要调节作用。肝星状细胞(hepatic stellatecell,HSCs)是肝脏中最重要的基质细胞,HSCs的持续激活是肝纤维化进程中的中心环节,与肝癌的发生发展密切相关,但HSCs在肝癌免疫应答中的作用尚不清楚。研究发现HSCs具有很强免疫抑制活性,能够诱导胰岛移植物的免疫耐受。但HSCs的这种免疫特性与肝癌发生发展之间的关系如何呢?为此本文将通过以下三个部分进行阐述与探讨。
第一部分小鼠肝星状细胞的分离、培养及其免疫特性的研究
目的:探索BALB/c小鼠HSCs分离、培养的方法及活化HSCs的免疫特性。
方法:经肝脏原位灌注、胶原酶消化后进行密度梯度离心获得HSCs。结合光镜下细胞的形态变化及特异性的表面标志物结蛋白和α-SMA表达鉴定HSCs。同时通过混合淋巴细胞实验检测HSCs对T细胞增殖的影响及蛋白芯片检测}ISCs分泌的细胞因子和趋化因子的情况。
结果:分离培养的HSCs纯度大于90％。活化的HSCs高表达desmin和α-SMA,能够明显抑制T细胞的增殖并分泌多种细胞因子和趋化因子。
结论:活化后的HSCs具有免疫抑制功能,能够分泌多种生物活性物质,为后续开展HSCs免疫调节活性与肝癌之间的关系奠定基础。
第二部分活化肝星状细胞促进肝癌的发生发展
目的:HSCs具有强大的免疫调节活性,但其免疫活性与肝癌之问的关系尚不清楚。这一部分主要研究活化的HSCs免疫抑制活性在肝癌发生发展中的作用。
方法:建立正常免疫小鼠皮下肝癌移植模型,将小鼠肝癌细胞株H22细胞单独或与HSCs联合种入小鼠皮下。注射后每2天对瘤子进行大小的测量。20天后对荷瘤小鼠行瘤组织解剖,免疫组化检测两组荷瘤小鼠肿瘤组织中Ki67、CD31与VEGF的表达。同时通过免疫组织荧光法检测T细胞和CD4+CD25+调节性T细胞浸润以及免疫抑制分子B7H1表达。TUNEL检测肿瘤组织中单个核细胞的凋亡。
结果:HSCs在体内外能够促进肝癌的生长。在小鼠肝癌模型中,共移植HSCs能够促进肿瘤的增殖、新生血管的生成以及营造局部免疫抑制微环境促进肝癌的发生发展。共移植HSCs抑制肿瘤组织中T淋巴细胞的浸润、诱导单个核细胞的凋亡并促进B7H1和调节性T细胞的表达。
结论:HSCs的免疫抑制活性能够促进肝癌发生发展,从免疫学角度阐明肝癌发生发展的机制,为肝癌的治疗提供新的靶点,靶向微环境中的基质细胞-HSCs,为肝癌的治疗提供新的思路。
第三部分活化肝星状细胞在肝癌微环境中促进免疫抑制性细胞的表达
目的:肿瘤微环境中的免疫抑制性细胞足介导肿瘤免疫逃逸的重要因素。HSCs能够营造免疫抑制微环境,但HSCs在肿瘤微环境中与免疫抑制性细胞之间的关系尚不清楚。这一部分主要通过建立小鼠原位肝癌移植模型,研究活化的HSCs在肿瘤微环境中对免疫抑制性细胞表达的影响。
方法:利用原位注射法进行小鼠肝癌模型的建立。通过流式细胞术检测荷瘤小鼠免疫状态的变化。在体内实验中,采用原位肝癌移植瘤模型,分为H22单纯注射组与H22+HSCs联合注射组。10天后对荷瘤小鼠行瘤组织解剖测量移植瘤大小;流式细胞术检测两组荷瘤小鼠脾脏中T细胞、Treg细胞以及骨髓和脾脏中髓系来源抑制性细胞MDSCs的表达;同时免疫组化法检测两组荷瘤小鼠肿瘤组织中Treg细胞、MDSCs细胞及肿瘤相关巨噬细胞TAM的表达。在体外实验中,通过混合淋巴实验分析H22活化的HSCs对Treg细胞增殖的影响,并通过流式细胞技术检测H22活化的HSCs对MDSCs的诱导作用。
结果:在小鼠原位肝癌模型中,小鼠肝癌细胞H22于原位肝脏成瘤性100％,荷瘤小鼠脾脏的重量和脾脏的细胞量较正常小鼠明显增加。通过流式细胞技术检测荷瘤小鼠较正常小鼠脾脏中Treg细胞表达增多,而且在脾脏及骨髓中MDSCs细胞的表达也明显增加。
共移植HSCs明显促进肝癌的生长。流式细胞术检测显示共移植HSCs组较单纯注射H22组脾脏中CD3/CD4+T以及CD3/CD8+T细胞比例明显降低,Treg细胞的比例明显升高;同时骨髓及脾脏中MDSCs细胞比例明显升高。免疫组化检测显示共移植HSCs组肝癌组织中Treg细胞、MDSCs细胞及。TAM细胞明显增加。体外实验结果显示活化的HSCs能够促进Treg细胞和MDSCs细胞的表达,而肿瘤细胞H122活化后的HSCs对Treg细胞和MDSCs细胞的表达又进一步的增强。
结论:建立的小鼠原位肝癌移植模型能较好体现临床肝癌的免疫学特点。HSCs营造的免疫微环境中浸润更多的免疫抑制性细胞,它们的存在进一步促进了肿瘤的免疫逃逸,促使肝癌发生发展。我们从一个全新的角度阐释了HSCs免疫调节活性促进肝癌发生发展的机制。