胶质瘤是最为常见的中枢神经系统肿瘤,约占全部脑肿瘤的一半以上,其起源于神经胶质细胞。所有胶质瘤生物学行为上都呈恶性表现,低级别胶质瘤生长缓慢,复发进展慢,而高级别胶质瘤具有生长快、弥散性侵袭、复发快,进展迅速,放化疗易耐受抵抗等特点,尽管目前以手术为主的综合治疗如放射外科治疗、术后放疗、化疗和免疫治疗等已有了长足的进步,高级别胶质瘤患者的预后仍较差,至今没有取得实质性进展。目前认为胶质瘤的发生发展是一个多因素参与、多步骤的复杂生物学过程,与基因突变关系密切,是多基因参与的基因网络失衡引起的。肿瘤干细胞(tumor stem cells,TSCs)学说的提出为肿瘤的治疗提供新的希望：肿瘤细胞群体中只有极少数的细胞具有干细胞特点,能无限增殖并能自我更新维持干细胞库的稳定,这种肿瘤干细胞在肿瘤的发生、进展和复发中发挥着关键根源性作用。如果治疗只杀灭了肿瘤细胞中不具备无限增殖能力的非干性细胞,而肿瘤干细胞存活下来,那么这部分肿瘤干细胞势必继续增殖分化形成新的复发灶,导致肿瘤的复发。因此,肿瘤治疗的成败主要取决于其中的肿瘤干细胞的清除。胶质瘤是最早鉴定并分离出肿瘤干细胞的肿瘤之一,脑肿瘤干细胞(Brain tumor stem cells,BTSCs)具有极强的免疫逃避、放疗耐受、化疗耐药及远处迁移等特点,使得胶质瘤尤其是胶质母细胞瘤对治疗表现出极大的抵抗,常规的治疗方法很难以根除。但是目前关于肿瘤干细胞特异性标志、肿瘤干细胞起源、维持自我更新的机制尚不完全清楚。如果能够揭示肿瘤干细胞的这些机制,就可以采用相应的干预,诱导肿瘤干细胞的分化,而抑制肿瘤生长。因此,胶质瘤肿瘤干细胞的基础研究,尤其是其分子特异性标志物、肿瘤干细胞自我更新的维持机制等研究有望成为攻克胶质瘤的关键。目前用于鉴定、分离脑肿瘤干细胞的标志物一般都是神经干细胞的标志物,而肿瘤干细胞本身没有特异性标志物。CD133(Prominin-1),SOX2,Nestin,Bmi1,Musashil,CD44,CD15,和ABC转运蛋白是最常用的鉴定和分离肿瘤干细胞的分子标志。目前的很多研究已经表明,单一的标志物作为脑肿瘤干细胞的标志物极不稳定与恰当,多个标志联合可能更准确。寻找脑肿瘤干细胞标志物是肿瘤干细胞研究与治疗的基础,所以寻找肿瘤干细胞标志物的脚步从未停止。MSI基因(Musashi)编码的RNA绑定蛋白最初在果蝇中发现,与果蝇硬毛的非对称发育有关。随后陆续在其他真核物种如蛙、小鼠、人等被发现,有两个进化上高度保守的同源基因MSll和MSI2。MSI作为RNA绑定蛋白在基因表达转录后调节的过程中起着重要的作用,参与RNA剪接、序列编辑、多聚腺苷化作用、RNA转运、维持RNA的稳定和调控RNA降解、细胞内定位和控制翻译等调控过程。已有研究证实MSI参与调控Notch信号通路,在神经干细胞和胚胎干细胞的自我更新维持中发挥着重要的作用。MSl1基因是研究最为广泛的MSI家族基因,在多种恶性肿瘤如胶质瘤、肠癌等中高表达,并且是预后不良的独立危险因素。最新研究发现MSl2基因在造血系统干细胞和造血系统恶性肿瘤干细胞中高表达并参与干细胞干性维持的调节,是预后不良的指标。虽已有研究发现MSll基因在胶质瘤中高表达,但关于MSl1基因在胶质瘤中的功能研究尚未见报道,而MSl2基因在胶质瘤中的研究尚未见报道。MSI基因是否在胶质瘤干细胞自我更新维持中发挥重要作用仍然未知。本研究拟从人脑胶质瘤组织标本及胶质瘤细胞系着手,系统研究MSI基因在胶质瘤中的表达、功能及其可能的作用机制。[MSI基因在人脑胶质瘤中的表达及与肿瘤干细胞的关系]本研究首先采用RT-PCR方法检测72例不同级别胶质瘤组织标本及8例正常脑组织中MSll和MSl2基因的表达,结果显示在胶质瘤中MSll和MSl2基因均较正常脑组织上调表达,而且表达水平与级别正相关,表达差异具有统计学意义(P<0.05),而与肿瘤大小、性别、年龄等因素无关。同样采用RT-PCR方法检测胶质瘤细胞系U251、U87、T98G中MSI基因的表达,结果显示MSll和MSl2基因在胶质母细胞细胞系中有明显表达。我们接着采用免疫组化技术分析MSI蛋白在胶质瘤组织中的表达及分布。为对实验条件标一化,我们将临床收集的72例胶质标本及8例正常脑组织标本制作成组织芯片。免疫组化结果显示MSll和MSl2蛋白在胶质瘤细胞胞浆和胞核中表达,在胶质瘤组织中表达较正常脑组织明显增强,且在高级别胶质瘤中较低级别胶质瘤表达明显增强,结果具有统计学意义(P<0.05),而与肿瘤大小、年龄、性别等无关。这些结果说明MSll和MSl2与胶质瘤的发生发展可能密切相关。我们进一步分析了MSI的表达与肿瘤干细胞的关系,同样采用免疫组化技术分析组织芯片中传统胶质瘤干细胞标志Nestin及ALDH1的表达,采用Spearman相关系数法分析MSI表达与干细胞标志的关系。结果显示MSl1和MSl2的免疫积分与组织中Nestin及ALDH1阳性细胞率呈明显相关性,结果具有统计学意义(P<0.05),说明MSI的表达与肿瘤干细胞相关。我们接着采用肿瘤干细胞培养方法在胶质瘤细胞系U251、U87、 T98G中分离培养肿瘤干细胞球,经Nestin免疫荧光及分化培养鉴定后,以普通培养条件下培养的细胞作为对照,采用免疫细胞化学技术分析MSI在肿瘤球中的表达,结果显示,在普通培养条件下,约60%肿瘤细胞表达MSll,40%肿瘤细胞表达MSl2,在肿瘤干细胞球中几乎所有细胞均有MSl1和MSl2的表达。抽提肿瘤球细胞总RNA及蛋白,分别采用qPCR技术及western blot技术分析MSI1、MSI2和Nestin的表达,结果显示,在肿瘤球中MSI1、MSI2和Nestin墓因mRNA及蛋白水平均高于普通培养细胞,结果具有统计学意义(P<0.05),进一步说明MSll和MSl2基因为胶质瘤肿瘤干细胞相关基因。因此,我们的研究发现MSI基因在胶质瘤中表达并与肿瘤干细胞密切相关,可能在胶质瘤发生、发展及肿瘤干细胞中发挥重要作用,为进一步研究提供了实验基础。[MSI基因在胶质瘤中的功能]采用RNA干扰进一步研究MSI基因在胶质瘤中的功能。首先根据MSll和MSl2基因序列设计干扰序列,化学合成si-RNA并利用RNAi MAX导入U251细胞,qPCR检测干扰效率,筛选出干扰效率最高的si-RNA序列。为了能更好研究基因功能,我们根据筛选出的干扰效率最高的siRNA序列合成寡核苷酸链,构建sh-RNAi-EGFP慢病毒载体,测序正确无误后与辅助载体共转染293T细胞进行病毒包装,病毒经浓缩,滴度测定及鉴定后浓缩后病毒测定病毒滴定达到实验要求,成功构建sh-MSI慢病毒。分别将sh-MSI1、sh-MSI2及sh-control慢病毒感染U251细胞。以sh-control组作为对照,qPCR检测干扰后MSI基因的表达。结果显示,sh-MSI1组MSl1基因为对照组0.13倍,而MSl2基因为对照组1.43倍,sh-MSI2组MSl2基因为对照组0.16倍,MSll基因反应性升高为1.34倍,在shMSI1+sh-MSI2组,MSll是对照组的0.16倍而MSl2是对照组的0.19倍,因此我们构建的慢病毒干扰载体能有效沉默靶基因,同时发现当干扰MSI基因中一个基因,其同源基因能反应性表达上调,也说明其两者在功能上可能具有重叠性。我们接着检测了MSI基因沉默后对U251细胞生物学行为的影响。利用MTT方法观察MSI基因沉默后对细胞增殖的影响,结果显示shMI1组、shMSI2组细胞增殖能力较对照组明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05), sh-MSI1+sh-MSI2能进一步影响细胞增殖,但结果较单一干扰组尚不具统计学意义。流式细胞术分析显示sh-MSI1、sh-MSI2组细胞在G2/M期数量明显增加(P<0.05),而G0/G1期及S期细胞比例明显下降(P＜0.05), sh-MSI1+shMSI2组改变更为明显。AnnexinV/PI流式细胞术分析细胞凋亡,结果显示shMSI1组及sh-MSI2组早期细胞凋亡及晚期细胞凋亡较对照组明显增加(P<0.05)。另外,划痕实验、迁移实验和基质胶侵袭实验结果显示sh-MSI1组及sh-MSI2组细胞迁移侵袭能力明显降低,而sh-MSI1+shMSI2组较单一干扰组迁移侵袭能力进一步降低(P<0.05)。上述结果提示MSI基因可能在胶质瘤细胞生物学行为的功能中发挥重要作用,可能为候选癌基因。采用平板克隆实验观察克隆形成能力,结果显示sh-MSI1组及sh-MSI2组克隆形成能力明显下降,sh-MSI1+MSI2组克隆形成能力进一步下降,差异均具有统计学意义(P<0.05)。进一步采用极倍稀释法检测MSI基因沉默对细胞在干细胞培养基中肿瘤球形成能力来判断MSI基因对于肿瘤干细胞的自我更新能力的影响,结果显示sh-MSI1组及sh-MSI2组肿瘤球形成率明显低于对照组(P<0.05)。提示干细胞相关基因MSI基因可能在肿瘤干细胞自我更新维持中发挥重要作用。[MSl2基因发挥作用机制的初步研究]Wnt信号通路是干细胞干性维持中的重要信号通路,并且在胶质瘤中异常激活,前期研究发现Wnt信号通路关键分子β-Catenin在胶质瘤中上调表达。为了进一步探讨MSl2基因在胶质瘤细胞中发挥作用的可能分子机制,采用Spearman相关系数分析,结果显示,β-catenin免疫积分与MSl2的免疫积分显著正相关(r=0.872,P<0.001)。进一步采用western blot技术分析sh-MSI2-U251细胞中β-catenin的表达,结果显示sh-MSI2组细胞中P-catenin表达较sh-control组明显下调(P<0.05),说明MSl2基因可能通过wnt信号通路发挥作用。进一步采用qPCR检测wnt信号通路抑制因子Dkk1的表达,结果显示sh-MSI2-U251组中Dkkl的表达为对照组sh-control-U251组的3.14倍,显著上调(P<0.05)。这些结果提示MSl2基因在胶质瘤中可能通过抑制DKK1的表达激活wnt信号通路而发挥调节肿瘤干细胞自我更新作用,虽有待进一步实验证实,但为研究提供了基础及方向。综上所述,本研究首次系统地研究了MSl1和MSl2基因在胶质瘤中的表达、与肿瘤干细胞关系、在胶质瘤细胞系中的功能以及在对肿瘤干细胞自我更新维持中的作用,并初步探讨了MSl2基因与wnt信号通路之间的关系。结果显示：MSl1和MSl2基因在人脑胶质瘤组织及细胞系中表达上调,与肿瘤干细胞密切相关,为潜在的肿瘤干细胞标志分子。MSl1和MSl2基因沉默后,显著抑制细胞增殖、迁移、侵袭,使细胞停滞在G2/M期而S期细胞减少,增加细胞凋亡而降低其恶性表现；并能抑制克隆形成能力并能显著降低肿瘤干细胞球形成,使肿瘤干细胞自我更新障碍。同时发现MSl2基因可能通过抑制Dkkl的表达而激活wnt信号通路。本研究将有助于全面地了解MSI基因在胶质瘤发生发展中的生物学功能及在肿瘤干细胞自我更新中的作用和可能分子机制,也为其潜在的临床应用提供理论和实验依据。