抗肿瘤坏死因子α(TNF-α)抗体能够中和高浓度TNF-α在机体内产生的各种有害效应，阻止其引起的如类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的发生和发展，在治疗多种相关疾病方面具有广阔的临床应用前景。已有许多实验证据表明，具有中和作用的抗TNF-α单克隆抗体能够预防和治疗因TNF-α过量而导致的炎症、感染性休克等相关疾病状态。我们利用噬菌体表面展示技术制备基因工程抗TNF-α单链抗体(scFv)，一方面建立了在体外大量制备抗体的简便的生产工艺，解决了目前TNF-α单抗制备工艺复杂、产量低的问题；另一方面由于scFv只含有抗体的重链可变区(VH )和轻链可变区(VL)片段，具有分子量小、免疫原性低、穿透力强的优点，克服了鼠源性单抗免疫原性强、分子量大、不易穿过血管壁的缺陷，使得抗TNF-α scFv在临床免疫治疗中具有良好的应用前景；第三，由于噬菌体展示技术实现了蛋白质表型和基因型的统一，使得该体系成为探索和分析蛋白质相互识别规律的一种极有价值的实验工具。本研究内容包括抗TNF-α噬菌体scFv抗体文库的构建，从中筛选、鉴定抗TNF-α scFv，用基因工程方法提高其表达量并进行人源化改造等工作，并对scFv重链可变区一级结构的保守性进行了初步分析。I 构建抗TNF-α噬菌体抗体scFv文库为了得到抗TNF-α scFv，我们首先构建了小鼠噬菌体单链抗体库。用rhTNF-α免疫小鼠后，间接ELISA方法测定免疫小鼠血清的抗体效价。结果表明其中两只小鼠的抗体效价介于10-5-10-6之间，符合构建抗体库的要求。分离免疫小鼠的脾细胞，提取总RNA，反转录成cDNA。以cDNA为模板，用重叠延伸PCR方法扩增得到scFv基因。此过程包括：①利用针对抗体重链和轻链可变区的引物分别扩增VH 和VL基因片段，将两种PCR产<WP=7>物进行纯化并测定浓度。②再用含Linker的引物将VH 和VL基因片段通过Linker连接起来形成scFv。③最后用含有相应酶切位点的引物扩增scFv，在scFv的5’端和3’端分别加上Sfi I和Not I酶切位点。经琼脂糖凝胶电泳分析，扩增的VH和VL基因片段的长度分别是360和330 bp左右，scFv基因片段的长度大约是750 bp。将scFv扩增片段纯化后，分别用Sfi I和Not I进行酶切，并与线性化噬粒pCANTAB 5 E体外连接。经限制酶酶切鉴定证实scFv片段以Sfi I/Not I位点定向插入噬粒的gpIII基因前方，将连接产物命名为pATF。用CaCl2法将连接产物转化感受态E.coli TG1，制备细菌形式的噬菌体单链抗体库，增加转化次数以提高抗体库的容量。通过菌落计数得到该抗体库的容量大约是4.6(106，大小中等。限制性酶切分析抗体库的重组率为83%。II 筛选抗TNF-α scFv阳性克隆及其鉴定我们利用rhTNF-α对抗体库进行筛选以得到TNF-α特异性噬菌体克隆。首先用rhTNF-α对抗体库进行3轮淘洗。用辅助噬菌体M13KO7感染转化菌，以挽救出噬菌体形式的抗体库。将此抗体库加入用rhTNF-α包被的酶标板内，孵育一段时间后洗涤，能够与抗原特异结合的scFv噬菌体克隆将被保留在孔内，然后用pH 2.2的Tris将结合的噬菌体洗脱下来，感染对数生长期E.coli TG1，以扩增抗原特异性噬菌体克隆。重复上述操作两次。这样，经过三轮“吸附－洗脱－扩增”的淘洗过程，抗体库中与TNF-α特异性结合的噬菌体克隆从第一轮后的3.5(104 pfu增加至第三轮后的6.0(108 pfu，被富集了17 000倍。Dot blot检测也显示了明确的富集效果。随机挑取40个克隆，用M13KO7感染后使scFv表达于噬菌体表面，ELISA筛选呈现有抗TNF-α scFv的噬菌体克隆。检测结果表明，有3个克隆的A490值最高，对这3个克隆重复ELISA检测发现均具有特异性抗原结合活性，而且与其它抗原没有交叉反应。其中有1个克隆(B18)结合抗原的灵敏度最高，因此选择该克隆作进一步研究分析。III 抗TNF-α scFv的可溶性表达及鉴定在噬粒结构基因中，位于scFv和gpIII基因之间有一个琥珀终止密码<WP=8>子(TAG)，当噬粒在抑制性E.coli TG1中表达时，TAG被通读而不起终止密码子的作用，scFv与gpIII以融合形式表达并展现于噬菌体颗粒表面。而在非抑制性E.coli HB2151中，TAG被识别为终止密码子，scFv以可溶性方式分泌至细菌胞周质中。我们将筛选得到的抗TNF-α噬菌体阳性克隆感染E.coli HB2151，建立抗TNF-α scFv可溶性表达体系并对其进行活性检测。将阳性克隆感染E.coli HB2151，30(C、IPTG诱导表达20 h，分别制备胞周质、培养基上清和全细胞提取物。经12% SDS-PAGE和Western blot分析，目的蛋白相对分子量为32(103，浓集于胞周质中，表达量占全菌总蛋白1%左右，将此可溶形式的抗TNF-α scFv命名为s-B18。用抗E-tag抗体亲和层析方法纯化位于胞周质中的s-B18，纯化后s-B18的回收率为0.3%，产量为3.3 mg/L。s-B18的活性测定采用以下方法：①竞争ELISA测定s-B18与TNF-α的亲和常数；②竞争ELISA检测s-B18对抗TNF-α IgG与TNF-α结合的抑制作用；③检测s-B18对TNF-α致L929细胞毒的中和作用；④Dot blot鉴定s-B18识别TNF-α表位的情况。结果表明，s-B18与TNF-α的亲和常数约为8(107 M-1，能够抑制抗TNF-α IgG与TNF-α的结合，且可以中和TNF-α对L929细胞产生的毒性作用，IC50为70 (g/ml。s-B18能够识别TNF