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T细胞在动物适应性免疫系统中发挥重要的作用,主要参与细胞免疫,具有信号传递、激活B细胞、杀伤靶细胞、调节免疫应答等功能,T细胞特异性免疫功能的行使需要通过T细胞表面受体(T cell receptor,TCR)来完成。之前的研究发现有颂类脊椎动物中都存在α、β、γ和δ四种典型的TCR基因类型,其蛋白产物可以形成αβ和γδ两种跨膜型异源二聚体。此外,在低等哺乳动物、鸟类、两栖类和软骨鱼中还存在非典型的TCR基因类型:TCRμ、VHδ(位于TCRα/δ位点的与免疫球蛋白重链可变区序列相似性更高的V基因)和NAR-TCR。爬行类动物在进化过程中是连接两栖类、鸟类和哺乳动物的纽带,目前对其TCR基因的研究还非常少,在很大程度上限制了我们对有颌类脊椎动物TCR基因进化模式和过程的理解。鳄目动物是现存较为原始的爬行类动物,同时被广泛认为具有强大的免疫系统。本研究选择中国特有的扬子鳄(Alligator sinensis)为研究对象,对其TCR基因进行了全面的分析。本研究首先利用鸟类TCR基因恒定区氨基酸序列在已经公布的扬子鳄基因组序列中进行搜索,得到扬子鳄的TCR基因恒定区的序列信息;再通过筛选扬子鳄基因组BAC(bacterial artificial chromosome)文库,对得到的含有TCR基因的17条BAC克隆中的9条进行全长测序并与基因组序列进行拼接,获得了包含扬子鳄TCRβ基因全长(约500Kb)、TCRγ基因全长(109Kb)、TCRα/δ基因大部分V区和全部C区(包含两个位点,位点A跨度约1 Mb,位点B长约400 Kb)的序列信息。结合RACE(rapid amplification of cDNA ends)实验获得的转录本序列信息和Southern blotting实验结果对获得的基因组序列进行分析并绘制基因位点图谱,发现扬子鳄TCRβ基因座的结构为 Vβ(39)-Jβ1-ψCβ1-Dβ2-Jβ2(11)-Cβ2-Vβ(4),TCRγ 基因座的结构为 Vγ(18)-Jγ(9)-Cγ。与其他物种相似,扬子鳄的TCRδ基因也位于TCRα基因座内,共有两个结构相似的TCRα/δ基因位点。位点A的结构为 V(104)-Dδ1(3)-Jδ1(3)-Cδ1-Jα1(91)-Cα1-VHδ(2)(包含 80 个 Vα/δ 和 26 个 VHδ),位点 B 的结构为 V(39)-Dδ2(3)-Jδ2(3)-Cδ2-Vδ-VHδ-Jδ3-ψCδ3-VHδ(3)-Dδ4-Jδ4-Cδ4-VHδ(2)-Dδ5-Jδ5-Cδ5-Jα2(63)-Cα2(包含37个Vα/δ和11个VHδ)。RACE实验证明位点A和位点B是相邻的,因为两个位点可以共用部分可变区基因,但基因组序列搜索和BAC克隆筛选暂时都无法确定其位置关系。表达水平的分析发现扬子鳄的所有TCR基因在表达过程中都不发生体细胞超突变(somatic hypermutation,SHM),但其CDR3中存在大量的N/P核苷酸。δ链能够使用至少50%的Vα基因和大部分有功能的VHδ基因,还能同时使用多个D基因,使其CDR3的序列和长度多样性大大增加。定量PCR实验表明在外周淋巴组织中γδTCR的表达量与αβ TCR的表达量基本相同,在小肠上皮等粘膜组织中γδ TCR的表达量更高。扬子鳄的TCRβ位点和TCRγ位点与其他物种在相应的基因位点上存在同线性关系,位点结构和表达机制与其他物种基本相同。扬子鳄的TCRα/δ位点中存在大量与Cδ共同表达的VHδ基因,这些VHδ基因主要分为三组:第一组(VHδⅠ)与鸟类中的VHδ相似性较高(VHClanⅠ);第二组(VHδⅡ)与鸭嘴兽和负鼠中的VHδ和Vμ相似性较高(VH Clan Ⅲ);第三组(VHδⅢ)与鳄目动物自身的IGHV(免疫球蛋白重链可变区基因)相似性最高(VH Clan Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中都存在),但多数为假基因,没有发现与Cδ基因共同表达的转录本。综合序列比对、进化分析和同线性分析的结果,本研究提出了羊膜动物TCRα/δ位点的一种可能的进化过程:爬行类、鸟类和哺乳类的共同祖先中只存在一个TCRα/δ位点,并且含有VHδ Ⅰ和VHδⅡ基因(VHδ Ⅰ也可能出现在哺乳类与爬行类分化之后),在低等哺乳类中保留了部分VHδ Ⅱ,并以此分化出TCRμ基因,在高等哺乳类中丢失了全部VHδ;爬行类与鸟类的共同祖先中发生了Cδ基因的复制(鳄目动物的Cδ基因分为三组:CδⅠ、CδⅡ和CδⅢ),鸟类中保留了部分VHδⅠ和CδⅠ,并复制出一个新的VHδ-Cδ位点;鳄目动物保留了 VHδ Ⅰ和VHδ Ⅱ,还出现了 VHδⅢ,并且发生了一次TCRα/δ位点的整体复制。扬子鳄的TCRα/δ位点B更加保守和古老,与其他物种的TCRα/δ位点存在同线性关系,位点A是鳄目动物出现后由位点B复制形成的,只保留了 CδⅠ,但TCRα/δ位点A的基因在淋巴组织中的表达量远高于位点B的基因,且位点A的V、J基因数量更多,在表达水平上的使用频率也更高。综上所述,本论文对扬子鳄TCR基因的位点结构、表达机制和进化特点等进行了多方面的研究,并总结了羊膜动物TCRα/δ位点的进化模式,这些研究结果为探索VHδ基因的起源和TCR基因的进化过程提供了重要的线索。