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本论文包括利用基因工程方法提高小麦光合效率及改良面包烘烤品质两个方面的研究,旨在探索通过小麦高光效育种技术途径提高产量,以及创建具优良烘烤品质的小麦种质材料。获得了以下主要研究结果: 一、玉米C4型pepc和ppdk基因的克隆及在转基因小麦中的表达 1.在玉米C4型pepc和ppdk基因的LA-PCR克隆中,发现甜菜碱对长片段PCR扩增的增强作用相当显著,最佳浓度从1mol/L到2.5mol/L。通过添加甜菜碱,从玉米基因组中扩增出9kb以上的单拷贝片段,从质粒中扩增出16kb以上片段。不同GC含量的引物需要使用不同浓度的甜菜碱。甜菜碱可以减少甚至消除长片段PCR中的非特异性扩增。 2.采用LA-PCR方法,从玉米克隆完整的C4型pepc基因。该基因与GenBank已登录的玉米C4型pepc基因序列的同源性达98.96%,mRNA同源性达99.38%,蛋白质的氨基酸推测序列同源性为99.38%。在DNA水平,两者有49处碱基差异,18处发生在内含子,18处发生在外显子。在mRNA水平,两者之间有15处差异,仅导致4个非连续排列的氨基酸差异。进一步构建了该基因包括5’启动子、3’非编码区以及内含予在内的完整序列(6.7 kb)和以CaMV 35S启动子驱动的bar基因为选择标记的表达载体pBAC214(12kb)。 3.采用LA-PCR方法分离、克隆玉米C4型ppdk基因,全长13.6kb。与GenBank已报道的序列比较,同源性为89.59%,存在149处变异(36处碱基插入、28处碱基缺失、40处碱基置换和45处碱基颠换)。变异主要发生在内含子部分。在mRNA水平上只有17处发生碱基的替换,导致3个氨基酸残基改变。构建了该基因的表达载体pBAC216(18.7kb),包括5’启动子、3’非编码区以及内含子在内的完整序列(13.6 kb)和以CaMV 35S启动子驱动的bar基因为选择标记。 4.通过PDS1000/He基因枪转化法,将pepc基因导入小麦外植体,获得再生植株29株,其中12株的点杂交结果呈阳性,Southern杂交鉴定结果表明,来自玉米pepc基因已与小麦基因组整合。对转基因小麦叶片的可溶性蛋白质SDS-PAGE电泳分析表明,该基因在小麦中正确转录、剪接和翻译。对转基因小麦叶片中酶活性的初步测定,发现部分转基因植株叶片中PEPC酶活性提高了3~5倍,与玉米叶片中的PEPC酶活性相当。