论文部分内容阅读
组蛋白脱乙酰基酶抑制剂（HDACIs）是一类有较好抗肿瘤生物活性的化合物,能抑制细胞增值,诱导细胞周期阻滞并引起肿瘤细胞调亡。HDACIs包括trichostatin A TSA（曲古抑菌素A）及其衍生物; the hydroxamic acids（异羟肟酸）及其衍生物如suberoylanilide hydroxamic acid （SAHA）;丁酸（butyric acid BA）及其衍生物;苯甲酰氨类衍生物（benzamides derivative）如MS-275等,最近新合成的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂MS-275、泰克地那林均进入二期临床试验阶段。目的本实验室通过对苯甲酰氨类衍生物（benzamides derivative）MS-275进行结构改造,得到一系列结构新颖的衍生物,其中MS-275-6在体外有较强的抗肿瘤活性,且具有良好的量效关系。本文进一步研究了MS-275-6对体外培养的肿瘤细胞和动物移植性肿瘤的抑制作用及特点,并初步探讨了它的作用机制。方法1 MTT法和SRB法检测MS-275-6的抗癌活性。用96孔培养板接种对数生长期肿瘤细胞和人的肾近端管状上皮细胞（HKC）,培养24h后,加MS-275-6（10μmol/L、1μmol/L、0.1μmol/L、0.01μmol/L）,96h后MTT法和SRB法测定MS-275-6在体外对细胞的生长抑制率以及对肿瘤细胞的GI50。用台盼蓝染色法检测药物对Hela和BGC-823细胞生长曲线的影响。2倒置光显微镜、荧光显微镜观察MS-275-6作用后肿瘤细胞形态结构改变。在对数生长期细胞中加入不同浓度MS-275-6,作用于K562细胞36h后倒置光显微镜观察照相并保留结果。MS-275-6作用于Hela细胞不同时间后,Hoechst33342染色,以紫外光（340nm）激发Hoechst,荧光显微镜观察照相并保留结果。3观察MS-275-6对动物移植性肿瘤的抑制作用。昆明鼠体内移植实体型S180肉瘤,接种S180肉瘤24h后,连续给MS-275-6（40mg/kg/d和80 mg/kg/d）10 d,于11 d处死动物,剥离肿瘤并称重,观察MS-275-6对实体瘤S180肉瘤的治疗作用。4琼脂糖凝胶电泳分析MS-275-6对Hela细胞染色体DNA断裂的影响。在对数生长期Hela细胞中加入不同浓度MS-275-6（2～8μmol/L）作用48h后抽提样本DNA,于1.5%琼脂糖胶电泳,电泳完成后用紫外光下观察并照相。5流式细胞术分析MS-275-6对Hela细胞周期的影响和诱导凋亡率的变化。收集对数生长期Hela细胞,加入化合物MS-275-6（2μmol/L,4μmol/L）,用流式细胞仪检测不同浓度的MS-275-6（2μmol/L,4μmol/L）作用24 h、36h、48 h和72h后对Hela细胞的影响。6 RT-PCR法检测不同浓度MS-275-6（1～4μmol/L）对Hela细胞p53、bcl-2、bax、p21mRNA表达的影响。7 Western-blot法检测不同浓度MS-275-6（1～4μmol/L）对Hela细胞CDK2蛋白质表达的影响。结果1 MS-275-6的体外抗肿瘤作用本文通过体外MTT和SRB方法发现MS-275-6对多数肿瘤细胞均有较好的抑制作用, IC50为4.20μmol/L～8.90μmol/L;单从体外的MTT结果来看,MS-275-6对癌细胞与正常细胞具有较好的选择性,对人的肾近端管状上皮细胞（HKC）的IC50 >10μmol/L。对Hela、BGC-823的GI50分别为6.49μmol/L、4.51μmol/L。通过对Hela、BGC-823细胞生长曲线的观察,发现不同浓度的MS-275-6对肿瘤细胞生长有明显的抑制作用,MS-275-6的抗肿瘤细胞活性略低于MS-275,但在同一数量级。2 MS-275-6的体内抗肿瘤作用连续口服MS-275-6（40mg/kg/d及80mg/kg/d）10d,对小鼠实体型肉瘤S180的生长抑制率分别为39.3%和36%,大剂量和小剂量与对照组相比均具有显著性差异（P<0.05）,且各剂量组小鼠体重与对照组小鼠体重无显著性差异（P>0.05）。说明MS-275-6在体内试验表现出良好的肿瘤抑制作用,且无明显毒副作用。而两个剂量对S180肉瘤的生长抑制率无显著性差异,考虑MS-275-6小剂量有比大剂量作用好的趋势,下一步考虑降低剂量重复实验,进一步考察MS-275-6的量效关系。3 MS-275-6对肿瘤细胞周期的影响本文采用流式细胞仪分析了MS-275-6对Hela细胞周期移行的影响。经不同浓度的MS-275-6（2μmol/L、4μmol/L）作用于细胞24h、36h、48h、72h,发现MS-275-6作用36h、48h、72h后使细胞各时相都有所抑制的同时,可使细胞周期阻断在G1期。4 MS-275-6诱导肿瘤细胞的凋亡MS-275-6能够诱导Hela细胞凋亡。不同浓度的MS-275-6（2μmol/L、4μmol/L）作用于Hela细胞36、48小时后,用荧光染料Hoechst 33342对细胞进行染色,在紫外光激发下发蓝色荧光,荧光显微镜下观察发现MS-275-6可使细胞核染色质发生聚集、碎裂,细胞核固缩呈均一的致密物,进而断裂,细胞膜不断出芽、脱落,细胞变成数个大小不等的凋亡小体,并且随着MS-275-6浓度的加大以及作用时间的延长,镜下这种细胞形态的变化愈来愈明显,表明凋亡细胞的比例逐渐增加。在DNA凝胶电泳实验中,用不同浓度的MS-275-6（2～8μmol/L）作用于Hela细胞48小时,提取DNA进行琼脂糖凝胶电泳,呈现典型的“DNA梯子”（DNA ladder）。流式细胞仪进行细胞的DNA含量测定,可见经不同浓度的MS-275-6（2～4μmol/L）作用于Hela细胞48小时后,出现一个“G1亚峰”,且凋亡细胞的比例随着MS-275-6浓度的升高和作用时间的延长而增加,呈一定的剂量与时间依赖性。从以上三方面的结果可以认为MS-275-6能够诱导肿瘤细胞的凋亡。5 MS-275-6对凋亡相关基因p53、bcl-2、bax、p21表达及周期相关蛋白CDK2表达的影响本实验观察了MS-275-6对凋亡相关基因p53、bcl-2、bax和p21的mRNA表达的影响。经不同浓度的MS-275-6（1～4μmol/L）作用于Hela细胞24小时,RT-PCR结果显示MS-275-6可增加p53、p21及bax的mRNA表达,同时降低了bcl-2mRNA的表达,结果同对照组相比均有显著性差异（P）,且呈一定的剂量依赖性。提示MS-275-6诱导细胞凋亡的作用极可能依靠上调了p53、p21以及Bax的mRNA表达,同时协同下调抑制凋亡基因Bcl-2的表达,从而诱导肿瘤细胞发生凋亡。本文观察了MS-275-6对细胞周期相关基因CDK2的蛋白表达的影响。经不同浓度的MS-275-6（1～4μmol/L）作用于Hela细胞24小时,western blot结果显示MS-275-6可使CDK2蛋白的表达量降低,且呈一定的剂量依赖性。结论MS-275-6在体外能够抑制肿瘤细胞的生长,其抗肿瘤细胞活性略低于MS-275,但在同一数量级。对于小鼠移植性肿瘤有较好的抑制作用。通过依赖p53途径,上调p21及bax,同时协同下调抑制凋亡基因Bcl-2的表达;下调细胞周期基因CDK2的蛋白表达,阻滞肿瘤细胞在G1期,从而诱导肿瘤细胞凋亡,有望成为一个新型的抗肿瘤化合物。