研究背景:心肌微血管内皮细胞（cardiac microvascular endothelial cells,CMECs）在调节和维持心脏功能中起着重要的作用。压力超负荷时,心肌细胞发生肥大,间质成分沉积增多,导致心脏发生肥厚,而在肥厚的心肌组织中,微血管含量相对不足,这就导致了这些组织的相对缺血、缺氧,病情持续进展就会导致心力衰竭。研究发现,有许多生物活性物质及调节途径在改善心肌局部微环境中发挥着重要的作用,而外泌体（exosome）介导的细胞旁分泌效应在近年来的研究中备受关注,外泌体也被视作心肌修复及微血管再生的关键调节器。Exosome中包装了许多生物活性物质,蛋白质、脂质、多糖、细胞代谢产物以及mRNA、miRNA和核糖体RNA等,其中miRNAs是一种高度保守的非编码RNA,在近些年的研究中越来越被重视。相关研究表明,外泌体参与了心脏肥大的过程,它将miRNA转移到相邻细胞,在细胞相互之间的通讯中发挥重要作用。我们实验小组前期的研究发现,血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）预处理的心肌细胞,其释放的exosome可通过传递高表达的miR-29a加重横向主动脉缩窄术后小鼠心肌肥厚,减少肥厚心肌组织中的新生血管密度。而目前,关于AngⅡ预处理心肌细胞源exosome miR-29a调控CMECs增殖、迁移及血管新生的机制研究尚未见报道。因此本实验拟在我们前期研究的基础上,在体外模拟建立压力超负荷应激微环境,探讨AngⅡ处理心肌细胞源exosome miR-29a对CMECs增殖、迁移及血管新生的调控作用及其相关机制。第一部分AngⅡ处理CMs-exosome miR-29a对内皮细胞增殖迁移及血管新生的作用研究目的:观察AngⅡ处理CMs-exosome miR-29a对对内皮细胞增殖迁移及血管新生的作用。方法:1、乳鼠原代心肌细胞培养:采用胰酶+Ⅱ型胶原酶联合消化法,结合差速贴壁法,并在培养基中添加5-溴脱氧尿苷（5-BrdU）,抑制其他细胞的生长,从而纯化体外分离培养的乳鼠心肌细胞,采用免疫荧光（immunofluorescence,IF）对我们所培养的心肌细胞进行鉴定,检测其特异性标记分子心肌肌钙蛋白T（cTnT）的表达情况。2、CMECs的传代培养、冻存、复苏及鉴定:本实验所使用的心肌微血管内皮细胞细胞株株,购自上海斯信生物科技有限公司,对其传代培养,并采用IF鉴定其特异性标记分子CD31的表达情况。3、AngⅡ处理心肌细胞:采用不同浓度的血管紧张素Ⅱ处理心肌细胞48小时,Western Blot检测各组中心衰蛋白:ANP、BNP、myh6、myh7等的表达量。使用鬼笔环肽标记细胞骨架,倒置荧光显微镜下观察Nor组与AngⅡ处理组的细胞大小。4、外泌体（exosome）提的取及鉴定:我们分别收集正常心肌细胞及AngⅡ预处理心肌细胞的细胞培养液,做好标记,然后采用超速离心法（ultracentrifugation,UC）分别提取正常心肌细胞来源的外泌体（Normal exosome,Nor-exo）与AngⅡ预处理心肌细胞来源的exosome（AngiotensinⅡexosome,AngⅡ-exo）。采用蛋白质印迹法（Western Blot）检测所提取外泌体的特异性表面标志蛋白分子CD9、CD63、Alix以及HSP70的表达;纳米颗粒追踪分析（nanoParticle tracking analysis,NTA）分析所提取外泌体的群体特征;透射电镜（transmission electron microscoPe,TEM）观察我们所提取外泌体的形态。5、Exosome内化的验证:用红色荧光染料Dil标记外泌体（300μg/mL）,与心肌微血管内皮细胞共培养8小时,IF观察内皮细胞对exosome的摄取情况。6、Exosome对内皮细胞增殖、迁移及血管新生的作用:为验证Nor-exo及AngⅡ-exo对CMECs增殖、迁移及血管新生的影响,实验分为3组:（1）Normal（Nor）组;（2）Nor-exo组;（3）AngⅡ-exo组;Nor组内皮细胞仅加入完全培养基,Nor-exo组向内皮细胞培养液中加入300μg/mL的正常心肌细胞外泌体,AngⅡ-exo组向内皮细胞培养基中加入300μg/mL的AngⅡ处理心肌细胞来源外泌体。应用FCM检测AngⅡ-exo对内皮细胞细胞周期的影响,EdU染色检测其对内皮细胞的增殖能力的影响;Western Blot检测其对增殖相关蛋白:PCNA、VE-cadherin、ZO-1等的表达的影响;采用Transwell细胞迁移实验检测其对CMECs的体外迁移能力的影响;采用基底膜实验检测其对内皮细胞成管能力的影响。7、Nor-exo与AngⅡ-exo中miR-29a的相对表达情况:采用qRT-PCR检测各组中miR-29a的表达量。8、MiR-29a对CMECs的作用验证:将miR-29a模拟物、抑制剂及其阴性对照物以riboFECT?CP转染试剂转染至内皮细胞,观察miR-29a对CMECs增殖、迁移及血管新生的影响。实验分组:（1）（1）Nor组;（2）miR-29a mimics组;（3）MNC（mimics negative control）组;（2）（1）Nor组;（2）inhibitors组;（3）INC（inhibitor negative control）组。应用FCM检测miR-29a对内皮细胞细胞周期的影响,Western Blot检测其对增殖相关蛋白:PCNA、VE-cadherin、ZO-1等的表达的影响;采用Transwell细胞迁移实验检测其对CMECs的体外迁移能力的影响;EdU染色检测其对内皮细胞的增殖能力的影响;采用基底膜实验检测其对内皮细胞成管能力的影响。9、验证CMs-exo主要通过传递miR-29a发挥抑制心肌微血管内皮细胞增殖、迁移及血管新生的作用,首先我们以riboFECT?CP转染试剂转染miR-29a及其阴性对照物至CMs,收集培养液,提取分别提取外泌体,用于后续实验;将miR-29a的阴性对照物转染至CMECs,实验分为4个组:（1）Nor组;（2）AngⅡ-exo组;（3）AngⅡ-exo+miR29a inhibitor组;（4）AngⅡ-exo+INC（inhibitor negative control）组;采用qRT-PCR检测不同处理组CMECs中miR-29a的表达情况。采用Western Blot检测各组中增殖相关蛋白PCNA、ZO-1、VE-cadherin的表达情况;FCM检测各组中的细胞周期;EdU染色检测各组细胞DNA的增殖能力;采用Transwell细胞迁移实验检测各组中CMECs的在体外环境的迁移能力;基底膜实验检测各组中CMECs血管新生的能力。结果:1、原代的乳鼠心肌细胞培养至24小时后显微镜下观察已有部分细胞已经贴壁,培养48小时后心肌细胞呈三角形、多边形和不规则形等生长,并且存在自主搏动。免疫荧光鉴定我们所培养的心肌细胞,其cTnT呈阳性表达。2、将我们所购买的心肌微血管内皮细胞株进行换液、传代,正常对数期生长的细胞为不规则形、梭形等,并呈铺路石样排列。免疫荧光对其鉴定,发现其特异性表面分子CD31呈阳性表达。3、不同浓度AngⅡ处理心肌细胞48小时后,各组中心衰蛋白:ANP、BNP、myh7等的表达量较对照组均有升高,且随AngⅡ浓度升高而升高,myh6表达量降低,然而10^-6mmol/L与10^-5mmol/L相比无明显差异,故后续实验选用AngⅡ浓度10^-6mmol/L即1umol/L为处理条件。使用鬼笔环肽标记细胞骨架,荧光显微镜下观察,与Nor组相比,AngⅡ处理组的心肌细胞表面积明显增大（P<0.05）。4、超速离心法分别提取Nor-exo及AngⅡ-exo,Western Blot结果显示我们所提取外泌体,其表面标记蛋白CD9、Alix、CD63、HSP70均呈阳性表达;透射电镜下观察见其为大小不一,形状为茶托形、椭圆形或双凹圆盘状的囊泡状小体;NTA结果显示两个样品的粒径峰值、均值都在30-150nm的范围内,颗粒大小均为109.4nm,说明从我们所提取的囊泡样物质为外泌体。5、Dil标记外泌体（300μg/mL）与CMECs共培养8 h后,荧光显微镜下观察发现内皮细胞已将大部分外泌体摄取。6、与Nor组及Nor-exo组相比,AngⅡ-exo组内皮细胞增殖数量、迁移数量及血管新生数量均减少（P<0.05）。7、通过qRT-PCR检测,与Nor及Nor-exo相比,AngⅡ-exo组中miR-29a的表达量明显升高（P<0.05）。8、结合我们课题组前期研究结果,在用慢病毒转染心肌细胞时,MOI=100的转染效率是最高的,在转染心肌微血管内皮细胞时,MOI=50时的转染效率最高的。因此本实验选择MOI=50为转染心肌微血管内皮细胞的最佳MOI值,MOI=100作为转染心肌细胞的最佳MOI值。与对照组及MNC相比,miR-29a mimics组内皮细胞的增殖、迁移及血管新生均受到抑制（P<0.05）,而inhibitors组呈现相反的趋势（P<0.05）。9、采用qRT-PCR检测各组中miR-29a的表达量,结果发现,与Nor组相比,AngⅡ-exo组及AngⅡ-exo+INC组,miR-29a表达量升高（P<0.05）,而AngⅡ-exo+miR-29a inhibitors组,其表达量最低（P<0.05）。与其他组相比,AngⅡ-exo组,内皮细胞增殖、迁移及血管新生作用均受到抑制（P<0.05）,而AngⅡ-exo+miR-29a inhibitors组在一定程度上逆转了AngⅡ-exo对内皮细胞增殖、迁移及血管新生的抑制作用（P<0.05）。小结:1、AngⅡ预处理的心肌细胞来源的外泌体可抑制CMECs的增殖、迁移及血管新生。2、在AngⅡ预处理的心肌细胞来源的外泌体中miR-29a呈高表达。3、miR-29a可抑制CMECs的增殖、迁移及血管新生。第二部分AngⅡ-exosome传递miR-29a通过抑制VEGFA,调控CMECs的增殖、迁移及血管新生目的:探讨AngⅡ-exosome miR-29a调控CMECs的增殖、迁移及血管新生的效应通过调节VEGFA实现的。方法:1、验证miR-29a与VEGFA的相关性:首先采用荧光素酶报告实验验证miR-29a是否可以与VEGFA相结合;然后用riboFECT?CP转染试剂转染miR-29a模拟物、抑制剂及其阴性对照物至CMECs,实验分组:（1）Nor组;（2）miR-29a mimics组;（3）miR-29a inhibitor组。采用Western Blot、qRT-PCR检测各组VEGFA的表达水平。2、VEGFA转染的验证:采用慢病毒转染的方法,过表达或沉默CMECs中VEGFA,实验分组:（1）（1）Normal（Nor）组;（2）Lentiviral vector（LV）组;（3）LV-VEGFA组;（2）（1）Normal（Nor）组;（2）Lentiviral vector（LV）组;（3）LV-VEGFA组。荧光显微镜下观察转染后的荧光强度;采用qRT-PCR、Western Blot检测不同处理组CMECs中VEGFA的蛋白及mRNA表达情况。3、MiR-29a与VEGFA相互作用的验证:实验分组:（1）Nor组;（2）miR-29a mimics组;（3）miR-29a mimics+LV-VEGFA组;采用Western Blot、qRT-PCR检测各组中VEGFA的蛋白及mRNA表达水平的差异;采用Transwell细胞迁移实验检测各组CMECs的体外迁移能力的差异,采用FCM检测各组中细胞周期的差异,基底膜实验检测各组中CMECs血管新生能力的差异。4、验证AngⅡ处理心肌细胞来源的外泌体通过传递miR-29a来抑制VEGFA的表达,进而对内皮细胞增殖、迁移、血管新生起抑制作用,实验分组:（1）Nor组;（2）AngⅡ-exo组;（3）AngⅡ-exo+LV-VEGFA组;（4）AngⅡ-exo+LV-VEGFA+miR-29a mimics组,采用Western Blot、qRT-PCR检测各组中VEGFA的蛋白及mRNA表达水平的差异;基底膜实验检测各组中CMECs血管新生能力的差异;采用Transwell细胞迁移实验检测各组CMECs的体外迁移能力的差异,采用FCM检测各组中细胞周期的差异。结果:1、荧光素酶报告实验结果显示,miR-29a可以与VEGFA特异性结合。Western Blot及qRT-PCR结果均显示,当miR-29a表达增高时,VEGFA的表达受到抑制（P<0.05）,而当miR-29a表达减低时呈现出相反的趋势（P<0.05）。2、Western Blot及qRT-PCR结果显示与空白对照组及空载体组相比,LV-VEGFA组,其VEGFA的表达量升高（P<0.05）,而VEGFA抑制组呈现出相反趋势,证明转染成功。3、与空白对照组相比,AngⅡ-exo及miR-29a mimics组VEGFA表达量明显降低（P<0.05）,内皮细胞的增殖、迁移及血管新生作用均受到抑制（P<0.05）;在过表达VEGFA时,miR-29a mimics也显示出对其的抑制作用（P<0.05）。小结:AngⅡ处理心肌细胞来源的外泌体通过传递miR-29a抑制VEGFA的表达,进而抑制CMECs的增殖、迁移及血管新生。结论:1、血管紧张素Ⅱ处理的心肌细胞可释放促心脏肥大的外泌体,此外泌体可以在体外抑制心肌微血管内皮细胞的增殖、迁移与血管新生。2、血管紧张素Ⅱ处理的心肌细胞源外泌体抑制心肌微血管内皮细胞增殖、迁移与血管新生的潜在机制可能是通过传递miR-29a抑制VEGFA的表达,从而发挥作用的。