我国原发性肝癌病死率居所有恶性肿瘤的第二位,占全部恶性肿瘤死亡人数的18.8%。乙型肝炎、肝炎后肝硬化则是我国肝癌发病率和病死率居高不下的主要原因。虽然手术切除仍是可能获得治愈的主要方法,但根治性切除术后复发率仍然相当高,还有更多的肝癌患者因肿瘤转移而失去根治的机会。这是肝癌患者临床治疗失败的主要原因,也是提高患者生存率和改善预后的重要障碍。因此探讨肝癌发生发展和转移复发的相关因素及分子机理,寻找肝癌早期诊断、预测转移的生物标记和干预治疗的靶分子,对于这种恶性肿瘤的诊断和治疗具有重要的理论指导和临床应用意义。Survivin基因由效应蛋白EPR-1(effector cell protease receptor-1)cDNA在人类基因库杂交筛选分离出来,全长14,700 bp,定位于17q25,编码产生一个由142个氨基酸组成、相对分子质量为16,500的蛋白质。Survivin的主要生物学功能是抗凋亡,是目前已知作用最强的凋亡抑制蛋白。目前,越来越多的学者发现Survivin在肿瘤细胞中表达,特别是在高转移潜能的肿瘤细胞中表达。有学者报道Survivin在转移的肝癌患者样本中表达的阳性率显著高于无转移患者,Survivin表达可能与原发性肝癌的肝内转移、门静脉癌栓等恶性生物学行为有关,但该方面研究较少,而且具体作用机制如何还不明确。本课题旨在通过对比和分析不同转移潜能人肝癌细胞系Survivin表达差异及肝癌组织有和无肝内转移病例中Survivin表达差异,研究Survivin与肝癌侵袭转移之间的关系;通过构建Survivin表达载体pEGFP-C1/survivin重组质粒,研究Survivin过表达后对肝癌细胞侵袭、转移恶性表型的影响;通过构建Survivin RNAi真核表达载体pGPU6/GFP/Neo-shRNA,探索下调Survivin基因表达对肝癌侵袭、转移的治疗效果,为肝癌转移的基因治疗提供新的靶点;并初步研究Survivin促进肝癌侵袭转移的作用机制。第一部分:Survivin在不同转移潜能肝癌细胞系及肝癌组织中的表达本部分实验目的是研究不同转移潜能人肝癌细胞系及肝癌组织中Survivin表达情况,分析Survivin表达与肝癌侵袭、转移之间的关系。应用RT-PCR和WesternBlot方法检测5种不同转移潜能人肝癌细胞系SMMC-7721、MHCC97-L、MHCC97-H、HCCLM3和HCCLM6细胞Survivin表达情况。收集35例原发性肝癌组织标本及相应的癌旁组织,其中包括20例无肝内转移病例及15例存在肝内转移的病例,RT-PCR和Western Blot方法检测Survivin表达情况。RT-PCR结果表明,具有相同遗传背景的转移潜能肝癌细胞系随侵袭转移潜能升高Survivin表达依次升高(P＜0.05),HCCLM6细胞Survivin表达水平最高,Western Blot结果与RT-PCR结果一致。肝癌组织Survivin mRNA表达均为阳性,而癌旁组织无一例阳性表达。Survivin mRNA的表达水平在肝内转移组(1.082±0.213)显著高于无肝内转移组(0.799±0.224,P＜0.05)。Western Blot的结果与RT-PCR结果一致。肝内转移组Survivin蛋白表达(0.892±0.198)显著高于无肝内转移组(0.342±0.237,P＜0.05)。以上结果表明,Survivin在原发性肝癌中表达,且与侵袭转移等肿瘤的恶性生物学行为有关,Survivin基因高表达可作为判断HCC侵袭性和进展的一个潜在重要指标。第二部分:Survivin过表达对肝癌细胞恶性表型的影响本部分实验目的是研究Survivin过表达后对肝癌细胞恶性表型的影响。首先构建Survivin表达质粒pEGFP-C1/survivin,将其转染低侵袭性无转移潜能人肝癌细胞SMMC-7721,以pEGFP-C1空质粒转染做对照,G418筛选获得稳定过表达Survivin细胞株C1和稳定转染空质粒细胞株C2,用Realtime PCR和Western Blot方法检测Survivin表达,体外MTT、黏附、运动、侵袭实验观察Survivin过表达后细胞恶性表型的变化。制备18只SMMC-7721细胞裸鼠肝脏原位接种模型,随机平均分成pEGFP-C1/survivin质粒组,pEGFP-C1空质粒对照组和PBS组。在肝脏原位接种肿瘤后第2天开始给药,腹腔注射质粒50gg/只,每周2次,连续给药6周后处死,解剖观察肝癌生长、转移情况,RT-PCR、Western Blot检测肝癌组织中Survivin和OPN表达,肺组织切片H.E.染色观察肺转移情况。肿瘤转移相关基因芯片比较C1和C2细胞株基因表达差异。用Realtime PCR验证有差异表达H-ras基因。并检测OPN基因、蛋白表达情况。结果表明,pEGFP-C1/survivin质粒经测序鉴定构建正确,将其转染SMMC-7721细胞,Survivin表达水平明显升高。体外试验显示C1细胞黏附、体外运动、侵袭能力明显高于C2细胞(细胞黏附率65.33%±7.24%vs 45.34%±5.52%,运动试验穿膜细胞数15.3±2.34 vs 5.3±2.53,侵袭试验透膜细胞数7.3±1.34 vs 4.3±1.25,P均＜0.05),MTT结果显示C1细胞24h、48h和72h三个时间点检测的OD值明显高于C2细胞检测值(P＜0.05)。裸鼠实验结果显示,pEGFP-C1/survivin质粒组肿瘤瘤重(2.72g±0.16g)明显重于pEGFP-C1空质粒对照组(1.79g±0.08g,P＜0.05)和PBS组(1.75g±0.07g,P＜0.05)。各组肝癌体积的差异趋势与瘤重一致,pEGFP-C1/survivin质粒组体积(1062.1mm~3+376.0mm~3)明显大于pEGFP-C1空质粒对照组(409.7mm~3±380.3mm~3,P＜0.01)和PBS组(460.8mm~3±32.3mm~3,P＜0.01)。pEGFP-C1/survivin质粒组6只裸鼠中有5只发生肺转移,pEGFP-C1空质粒对照组和PBS组均无肺转移发生,且pEGFP-C1/survivin质粒组3只发生肝内播散,而pEGFP-C1空质粒对照组和PBS组裸鼠均无肝内播散。RT-PCR及Western Blot结果显示pEGFP-C1/survivin质粒组Survivin和OPN表达水平明显高于pEGFP-C1空质粒对照组和PBS组。基因芯片比较发现稳定高表达Survivin后,有16个肿瘤转移相关基因表达上调(H-ras、CTNNA1、CTNNB1、IL8RB、MMP3、ITGB3等),2个肿瘤转移相关基因表达下调(TCF20和TP53)。Realtime PCR和ELISA结果显示C1细胞H-ras和OPN表达水平明显高于C2细胞。以上结果表明,Survivin基因表达上调后可促进肝癌细胞SMMC-7721的恶性侵袭转移表型。Survivin高表达可引起多个肿瘤转移相关基因表达水平改变,其中包括与肝癌侵袭、转移密切相关的H-ras和OPN基因。第三部分:Survivin基因RNAi体外及体内研究本部分实验进一步观察Survivin对肝癌细胞侵袭转移能力的影响,通过靶向Survivin RNA干扰抑制Survivin表达,观察高转移人肝癌细胞系HCCLM6细胞生长、黏附、侵袭能力以及体内肿瘤生长及转移行为的改变,探索靶向Survivin基因RNAi对肝癌侵袭、转移的治疗效果。首先设计、合成Survivin siRNA,瞬时转染HCCLM6细胞,Realtime PCR和Western Blot检测干扰效果。筛选出干扰效率较高靶点用于合成shRNA,构建pGPU6/GFP/Neo-shRNA干扰质粒。重组质粒瞬时转染HCCLM6细胞,Realtime PCR和Western Blot验证干扰效果,筛选出干扰效率较高的shRNA重组质粒进行后续体内、体外实验。应用MTT、黏附实验、细胞运动、侵袭实验观察细胞增殖、黏附、运动、侵袭能力的改变。Realtime PCR及ELlSA方法检测瞬时转染shRNA干扰质粒后细胞H-ras和OPN表达。裸鼠实验观察腹腔注射Survivin干扰质粒对肝癌生长、转移和裸鼠生存期的影响。RT-PCR和Western Blot检测裸鼠肝癌组织Survivin和OPN表达水平。结果表明,针对Survivin基因设计的siRNA均有一定程度的干扰作用,Realtime PCR显示其中siRNA-166、siRNA-358的干扰作用较强,可使靶基因分别下调80%和70%,WesternBlot结果与Realtime PCR结果一致,siRNA-166和siRNA-358可使Survivin蛋白分别下调72%和65%。分别构建siRNA-166和siRNA-358两种pGPU6/GFP/Neo-shRNA重组质粒,并分别命名为shRNA1和shRNA2,经测序鉴定插入位点正确。Realtime PCR检测两种重组质粒干扰效果,结果示shRNA1和shRNA2对Survivin mRNA抑制率分别为78%和65%,蛋白抑制率达75%和68%,故选择shRNA1进行后续实验。shRNA1转染HCCLM6后,体外增殖能力明显降低,黏附率明显低于阴性对照质粒转染细胞,两者差异有显著性(43.28%±0.85%vs55.09%±1.45%,P＜0.01);细胞运动、侵袭能力明显降低,与阴性对照质粒相比两者差异有显著性(侵袭试验透膜细胞数10.5±1.29 vs 20.5±1.29,P＜0.0l,运动试验穿膜细胞数15.8±0.96 vs 23.5±1.29,P＜0.01)。Realtime PCR结果显示细胞瞬时转染shRNA1干扰质粒后,细胞H-ras和OPN mRNA表达降低,细胞上清OPN蛋白分泌量明显减少(P＜0.0])。裸鼠实验表明,shRNA1质粒组肿瘤瘤重(1.43g±0.20g)低于阴性对照质粒组(2.]9g±0.37g,P＜0.01)和PBS组(2.34g±0.55g,P＜0.01)。shRNA1质粒组肿瘤体积(679.22mm~3±328.72mm~3)小于阴性对照质粒组(1397.03mm~3±374.49mm~3,P＜0.01)和PBS组(1636.50mm~3±508.80mm~3,P＜0.01)。阴性对照质粒组和PBS组6只裸鼠都发生了肺转移,而shRNA1质粒组只有2只裸鼠发生肺转移。shRNA1质粒组荷瘤裸鼠的生存期为70.7天±1.97天,与阴性对照质粒组(40.8天±2.32天)和PBS组(37.5天±4.28天)相比差异显著(P＜0.01)。RT-PCR及Western Blot结果显示shRNA1质粒组Survivin和OPN表达水平明显低于阴性对照质粒组和PBS组。以上结果表明,Survivin基因可通过促进肝癌细胞增殖,增强细胞黏附力、细胞运动、侵袭能力参与原发性肝癌的生长和转移,Survivin基因下调后肝癌细胞侵袭潜能下降,裸鼠肝癌生长抑制,转移能力降低,故认为Survivin是潜在的治疗原发性肝癌侵袭、转移的靶标。第四部分:Survivin促进肝癌细胞恶性表型机制的初步研究第二、三部分研究结果表明,Survivin基因过表达后,OPN和H-ras基因表达上调;而当干扰Survivin基因表达时,OPN和H-ras基因表达下调。本部分通过研究三者之间的关系,以初步探讨Survivin促进肝癌侵袭转移的作用机制。首先构建Survivin表达质粒pcDNA3.1(-)/survivin和Survivin RNA干扰质粒pGPU6/shRNA,并分别瞬时转染细胞检测Survivin表达变化。构建含有OPN基因启动子的荧光素酶报告质粒pOPNGL3并鉴定。设计并化学合成H-ras siRNA序列,瞬时转染HCCLM6细胞观察千扰效果,筛选出干扰效果较好的靶点用于后续实验。将pcDNA3.1(-)/survivin和pOPNGL3共转染SMMC-7721细胞,通过检测荧光素酶活性反映OPN基因启动子活性,观察OPN基因启动子活性的变化。将pGPU6/shRNA和pOPNGL3共转染HCCLM6细胞,观察OPN基因启动子活性的变化。将H-ras siRNA和pOPNGL3共转染HCCLM6细胞,检测OPN基因启动子活性。将pcDNA3.1(-)/survivin、H-ras siRNA和pOPNGL3共转染HCCLM6细胞,与共转染pcDNA3.1(-)/survivin、siRNA-NC、pOPNGL3细胞(对照组1)和共转染pcDNA3.1(-)、siRNA-NC、pOPNGL3细胞(对照组2)对比,观察OPN基因启动子活性差异。结果表明:通过测序鉴定pcDNA3.1(-)/survivin和pGPU6/shRNA重组质粒构建正确。pcDNA3.1(-)/survivin重组质粒瞬时转染SMMC-7721细胞后,Survivin mRNA表达水平升高,为SMMC-7721细胞2.173倍,高于空质粒转染细胞(相对SMMC-7721细胞1.035倍)。干扰质粒pGPU6/shRNA瞬时转染HCCLM6细胞后,Survivin mRNA表达水平明显低于空质粒转染细胞,抑制效率达70.5%。测序鉴定OPN基因启动子的荧光素酶报告质粒pOPNGL3构建正确。4组H-rassiRNA分别瞬时转染HCCLM6细胞进行Realtime PCR检测,结果发现v-H-ras-121、v-H-ras-282、v-H-ras-305、v-H-ras-489干扰效率分别是51%、75.3%、65.6%、34.5%,故选择v-H-ras-282进行后续试验。Survivin过表达后,SMMC-7721细胞OPN基因启动子活性升高了187.76%。Survivin基因干扰后,HCCLM6细胞OPN启动子活性降低了61.3%。H-ras基因干扰后,HCCLM6细胞OPN启动子活性降低了59.5%。pcDNA3.1(-)/survivin、H-ras siRNA共转染HCCLM6细胞,三组RLU(相对发光值)分别是16.31±0.67(×10~4)、37.69±1.34(×10~4)和15.86±0.32(×10~4),实验组与对照组1相比,荧光素酶相对活性明显低于对照组1(P＜0.01),而与对照组2相比,没有明显差异(P＞0.05),说明Survivin过表达对OPN启动子的激活作用,可以被H-ras表达下调所阻断。以上结果表明,Survivin过表达可以促进OPN基因启动子活性;H-ras基因可以通过调控OPN启动子活性,调控OPN基因表达;Survivin促进OPN启动子活性的作用可以被H-ras RNAi阻断。故认为Survivin、H-ras和OPN三者之间可能存在密切的联系,Survivin可能是通过促进H-ras基因表达激活OPN基因转录,进而使其表达上调,发挥促进肝癌侵袭转移的作用。结论1.Survivin表达和肝癌细胞侵袭转移能力相关:肝癌组织中Survivin表达与肝内转移有关。2.Survivin能促进肝癌细胞系SMMC-7721侵袭转移恶性表型。Survivin高表达可引起SMMC-7721细胞H-ras、OPN等多个肿瘤转移相关基因表达改变。3.RNA干扰下调Survivin表达后,肝癌细胞HCCLM6增殖、黏附、侵袭能力下降,并引起裸鼠体内肿瘤生长抑制及转移能力下降,故认为Survivin是潜在的治疗原发性肝癌侵袭、转移的靶标。4.原发性肝癌中Survivin高表达可以上调H-ras基因表达水平,而H-ras基因可以通过调控OPN启动子活性,上调OPN基因表达,Survivin、H-ras和OPN三者可能存在密切的联系,并且发现Survivin促进OPN启动子活性的作用可以被H-ras基因下调所阻断。故认为,Survivin促进肝癌侵袭转移作用的部分机制可能是通过促进H-ras基因表达,激活OPN基因转录实现的。创新点1.发现并证实Survivin参与肝癌侵袭转移过程,为预测和治疗原发性肝癌转移复发提供了新靶标。2.初步探索靶向Survivin的RNA干扰对肝癌细胞体外生长、侵袭、黏附力的影响及抑制体内成瘤、转移的治疗效果。3.初步探索了Survivin促进肝癌侵袭转移的作用机制,提示Survivin、H-ras和OPN三者可能存在密切的联系,Survivin促进肝癌侵袭转移作用的部分机制可能与Survivin促进H-ras基因表达,激活OPN基因转录有关。潜在应用价值1.Survivin是抑制肝癌复发转移的潜在治疗靶点。2.为深入研究Survivin参与肝癌侵袭转移的机制提供实验基础。