背景:癫痫是一类发病率高、机制复杂的神经系统疾病,多数难以根治,严重影响患者的身心健康和社会功能。颞叶癫痫是一种很常见的癫痫类型,颞叶癫痫发作引起的海马神经元损伤和死亡被认为是癫痫发生发展中的重要环节。现有的动物实验和人体实验都表明,颞叶癫痫发作会激活一系列促凋亡信号通路,最终引起海马区神经元凋亡;而与此同时,细胞内的抗凋亡通路也会反馈性激活,在一定程度上起到保护作用。B细胞淋巴瘤蛋白2(Bcl-2)是一种抗凋亡蛋白,目前已发现该蛋白在颞叶癫痫发作时表达上升,然而鲜有确切证据表明人工上调bcl-2基因表达能减轻颞叶癫痫引起的海马损伤。目的:本研究旨在探讨人工bcl-2过表达是否会对减轻颞叶癫痫引起的海马神经元损伤。内容:通过构建bcl-2基因过表达慢病毒载体,在小鼠海人酸颞叶癫痫模型中研究Bcl-2蛋白过表达对海马细胞凋亡的影响,进而探讨Bcl-2通路与颞叶癫痫发生发展的关系。方法:1.构建bcl-2基因过表达慢病毒载体:人工合成小鼠bcl-2基因片段,PCR扩增后连接pLV慢病毒载体,导入DH5α大肠杆菌菌株,进行克隆。2.病毒包装:用三质粒慢病毒系统共转染HEK293T细胞系,进行病毒扩增和包装。3.小鼠海马病毒注射手术:对8周龄雄性C57BL/6J品系小鼠行10 ml/kg体重5%水合氯醛腹腔注射进行麻醉,用75%乙醇消毒后剪开头顶皮肤,并用30%过氧化氢溶液腐蚀筋膜。在脑立体定位仪下用小电钻在双侧海马对应的颅骨位置打孔,然后用微量注射器向双侧海马注射病毒液各1000 nL。4.小鼠癫痫模型构建:病毒注射1周后对小鼠予以18 mg/kg体重海人酸腹腔注射诱导癫痫。5.表达验证:癫痫诱导2h后将小鼠处死,剪开颅骨取出大脑半球,沿正中线切开,选取一个大脑半球的海马组织进行Western Blot验证Bcl-2表达。6.切片镜检:将另一大脑半球置于福尔马林溶液中固定48h,之后换为80%乙醇脱水,进行石蜡包埋海马切片,脱蜡后行苏木素染色并封片,在光学显微镜下对海马齿状回锥体细胞死亡数量进行计数。结果:1.克隆质粒中目的基因序列与原基因序列一致,病毒构建成功。2.Western Blot结果表明注射bcl-2基因上调慢病毒的小鼠,Bcl-2蛋白在海马中的表达显著升高。3.海马组织切片染色结果显示bcl-2基因表达上调的小鼠海马齿状回锥体细胞死亡数量显著低于对照组。结论:Bcl-2通路参与了海人酸诱导的颞叶癫痫所致海马神经元凋亡过程,人工上调bcl-2基因可以进一步对海马神经元起到保护作用。