花粉萌发和花粉管生长是被子植物完成有性生殖不可或缺的关键生理活动。花粉管生长是一种典型的顶端极性生长方式,依赖精准的“运输系统”保障其顶端快速地生长。Rab GTP酶是一类在真核生物中保守存在的囊泡运输相关蛋白,在囊泡形成、转运、栓系、融合、以及不同途径的内膜转运过程中都起着至关重要的作用。其中Rab A、Rab D等亚家族的少数成员被证明参与花粉发育和花粉管极性生长过程。尤其是GFP-Rab A4d标记的囊泡特异地分布在花粉管顶端,但参与调控其极性分布的机理还未见报道。在真核生物中,磷脂酰肌醇-磷酸（PIPs）、磷脂酰丝氨酸（PS）和磷脂酸（PA）等带负电的磷脂通过产生膜电位和膜曲度等方式直接参与调控Rab GTP酶的定位和功能。磷脂酰肌醇-4-磷酸（PI4P）、PIP2和PA主要定位在花粉管质膜上,而PS在烟草花粉管顶端则主要分布在“倒锥形”的囊泡区,暗示着PS可能参与花粉管顶端Rab GTP酶介导的囊泡运输。另外,PS在植物细胞中的不对称分布依赖于P4-ATP酶（也叫做氨磷脂ATP酶;Aminophospho Lipid ATPases（ALAs））利用ATP水解的能量将其从质膜的外侧和细胞器膜内侧翻转至细胞的胞质侧。拟南芥ALA家族部分成员被证明参与生长发育、生物和非生物胁迫等重要的生理过程。然而,目前对于参与调控花粉管中PS极性分布的ALAs,以及花粉管中PS的亚细胞定位和生物学功能还未见报道。本文主要通过遗传学、细胞生物学、体外生化等方法研究了ALA3在花粉管极性生长中的功能,阐明了PS在花粉管中的极性分布模式,探讨了PS通过促进Rab GTP酶参与的囊泡极性运输来调控花粉管极性生长的作用机理,取得了如下成果:1、揭示了ALA3在花粉管极性生长中的作用。ALA3功能缺失不仅抑制了花粉管的生长,还导致花粉管宽度增加,以及花粉管在体外对BFA的敏感性降低;外源ALA3能完全回补花粉管宽度的表型并部分回补花粉管长度的表型,而具有磷脂翻转活性的保守位点突变后的外源ALA3(ALA3D413N)完全不能回补其突变体花粉管的表型,表明ALA3通过其保守的磷脂翻转酶活性来调控花粉管极性生长。2、研究发现ALA3在花粉及花粉管中大量表达,ALA3功能缺失导致本应在花粉管顶端分布的、由FM4-64、YFP-Rab A4b和RFP-Rab A4d标记的极性运输囊泡在亚顶端大量聚集而不能前往顶端,最终导致顶端部位的囊泡数量急剧减少,表明ALA3对囊泡极性运输至关重要。3、通过在花粉管中表达ALA3-GFP,发现ALA3在花粉管顶端呈极性分布,表现为在顶端倒锥形区域有更强的荧光信号;通过对ALA3-GFP与各种融合了荧光标签的细胞器标记蛋白的共定位分析,发现ALA3主要定位于花粉管顶端质膜、TGN/EE、后高尔基体和循环胞内体中。4、遗传研究表明ALA3和Rab A4d通过相同的遗传途径调控花粉管宽度。ala3 raba4d双突变体花粉管的宽度相对两个单突变体没有明显增加,raba4d花粉管中囊泡的极性分布丧失,数量也明显减少,表明raba4d花粉管中囊泡分布模式与ala3中的类似。5、ALA3功能缺失导致PS在花粉管中的分布模式异常。通过在花粉管中表达胞质侧PS sensor EGFP-Lact-C2,并与各种融合了荧光标签的细胞器标记蛋白进行共定位分析,结果表明PS的分布模式及亚细胞定位模式与ALA3-GFP类似;ALA3功能缺失导致胞质侧PS的总量明显减少,并导致本该在花粉管顶端极性分布的PS大量聚集在亚顶端;同时,体外生化结果表明PS能够与各种活性形式的Rab GTP酶结合。6、ALA3通过调控花粉管中TGN/EE的形成以及分泌型Rab GTP酶的极性定位和分布来控制囊泡的形成和极性运输,从而调控花粉管细胞壁组分的沉积,最终影响了花粉管的极性生长;ALA3很可能是通过调控PS在花粉管中的分布,进而影响到PS与各种活性形式的Rab GTP酶的结合来影响Rab GTP酶的分布和活性。