目的：高度降解DNA的分型问题一直是法医DNA检验的难点。大规模灾难性事件、命案现场、恐怖袭击后的个人识别工作,多涉及高度腐败降解检材的检测与分析。高温、潮湿、紫外辐射、土壤微生物、强酸和强碱等因素都会使检材中的DNA分子被损坏,从而发生断裂,分子变小,大片段丢失,碱基缺失,碱基修饰,因此减少了生物检材中完整的目标片段含量,导致PCR扩增不良,甚至扩增失败或目标基因座错误分型。目莉常用检测降解DNA策略有：①通过增加循环次数和模板量等方法提高PCR反应灵敏度。②用减小扩增片段长度的方法来分析降解检材。如分析MiniSTR和SNP两种遗传标记。③利用mtDNA模板高拷贝数提高分析成功率。但是染色质DNA固有结构性质常被忽略。核小体作为真核染色质最基本的重复结构单元,由DNA和组蛋白两个部分构成。核小体)NA长200bp,分为核心DNA和连接DNA两个部分。核心DNA包绕在组蛋白八聚体上,长度为147bp左右。有多方面证据表明核小体对于与其结合的DNA极有可能具有保护作用。如凋亡细胞的DNA会被内源性核酸酶消化致多条200bp左右的条带。普遍认为这种ladde r样条带为组蛋白八聚体对核心DNA具有保护作用所致,同样作用也可见于细胞溶解坏死时。D ixon等研究表明由于酶的限制性作用核小体可对与其结合的47bpDNA起保护作用。另有对古DNA的研究显示,已提取的古DNA片段绝大多数为100-200bp,与缠绕单个核小体的DNA长度吻合,推测为核小体DNA或核心DNA,提示核小体对DNA具有一定的保护作用。另有研究报道两个团队采用软件预测的核小体定位信息筛选STRs与SNP遗传标记并进行法医学验证,却得到了相反的结果。基于预测软件筛选核小体遗传标记,虽然具有方便快捷节省经费的优点,但由于软件是根据核小体序列偏好性,弯曲度等参数进行预测,与实际定位存在一定程度偏差。本研究从构成染色质DNA的固有性质出发寻找检测降解检材的突破口吏用IlluminaHiseq 2000 Genome Analyser分析平台获得人类白细胞核小（?）区与非核小体核心DNA区内遗传标记在降解DNA中的差别,来探讨核小体对降解DNA的检验影响,以期在确定其有抗降解性的前提下,开发更利于降解检材分析的核小体遗传标记体系。从而为降解DNA的检验提供全新的技术手段及发展方向。方法：1从健康人外周血收集白细胞,使用微球菌核酸酶进行消化提取核小体核心区DNA。使用Illumina Hiseq 2000 Genome Analyser分析平台对获得的核小体核心区DNA进行测序,获得数据产出总量,测序覆盖度等测序数据概况。对获得的DNA测序数据中SNPs、Indels、STRs这三种遗传际记的分布情况进行分析,筛选出位于核心区与非核心区内的遗传标记;2对筛选出的位于核小体核心DNA区域内的法医学常用STRs,以相同数目的非核心DNA区域内法医学常用STRs为对照,通过进一步设计引物使扩增片段长度小于147bp,使用实时荧光定量的方法和毛细管凝佼电泳分析技术对人工降解检材和实际案件检材进行分析,比较核小体不司区域内法医学常用遗传标记的抗降解性差异。3对第一部分获得的未经报道的核小体STR候选基因座进行群体遗传学调查和法医学参数评价,将最终筛选的具有法医学应用潜力的未经报道的核小体STR基因座与第二部验证的具有良好抗降解性的核小体法医学常用STR基因座,一并构建核小体STR复合扩增体系。比较该体系与MiniFilerTM式剂盒在降解检材检测中的差异,同时将核小体STR复合扩：曾体系与MiniFilerTM试剂盒中各基因座测序所获核小体定位信息与核小体软件（NuScore软件）预测结果进行比较,进一步分析测序对于获得准确核小体遗传标记的重要性。结果：1第一部分结果：①测序所获数据概况：成功提取了人类血液白细胞内核小体核心DNA并进行了Solexa高通量测序,总共获得reads数目为17,752,559 2×100双末端reads,读长为10lbp。其中可比对到基因组唯一位置reads数目为26,750,300,占可比对数目的75.34%。实验所获reads的平均GC含量为52%,平均基因组覆盖率约为34%（1042463676/3095693983）,其中22号染色体覆盖率最低,为27%：X染色体覆盖率最高,可达52%。测序深度可达3×。通过测序reads与参考基因组（human genome, hg19）比对所获reads中大多数分布在intergenic和ntronic区域内,分别达到了52.5%和38.8%。②所获测序reads中核小体遗传标记概况：本研究共筛选到至少有10条reads支持的单核苷酸变异[single nucleotide variations, SNVs)共2462个,至少有10条reads支持的：插入缺失位点（Insertion-deletion polymorphisms, indels）128个,其中大部分遗传标记位于intergenic区域。在检测到的2462个SNVs中有2220个SNVs在dbSNP138数据库中存在记录,242个SNVs为该样本特有,不存在于dbSNP138数据库中。在检测到的128个indels中有89个indels在dbSNP₁38数据库中存在记录,39个indels为该样本特有,不存在于dbSNP₁38数据库中。使用两种方法对所获reads中STRs进行筛选。将获得的reads中的STR与法医学常用的44个STRs进行比对。共有5个STRs被筛选到,即TH01、TPOX、D18S51、DYS391 和 D10S1248。通过编写程序进行STR的分析。从两个角度进行了编程筛选。编程方法1侧重于筛选听得STR位于核小体线性定位的中心部分;编程方法2侧重于筛选所得TR位于测序深度较高的reads部分。当满足编程筛选方法1全部条件时共筛选到10167个STRs;当满足编程筛选方法2的前4个条件时筛选到95126个STRs当满足全部5个条件时可见有468种重复序列入选。两种方法均包括使用方法一筛选到的5个法医学常用STRs即THO1、TPOX、 )18S51、DYS391 和 D10S1248o2第二部分结果：①选择第一部分筛选的5个核小体法医学常用STRsD10S1248、D18S51、TH01、TPOX和DYS391)和5个非核小体法医学常用STRs（CSF1PO、D5S818、D8S1179、D16S539和DYS392）进行抗降解性比较。② Mann-Whitney U Test分析显示两组扩增子片段长度无差异。③实时荧光定量结果显示伴随着DNase Ⅰ消化时间的增加,在5例人工降解检材中各基因座的含量均呈现明显的下降趋势。重复测量方差分析阳多元方差分析对各时间点核小体组STRs和非核小体组STRs基因座含量分析结果显示在5min、10min、20min寸,被分析的5例人工降解检材中核小体组STRs与非核小体组STRs均存在差异。④毛细管凝胶电泳结果显示在20例人工降解检材中,经Mann-Whitney U Test分析核小体组STRs基因座检出率明显高于与非核小体组STRs（P=0.001<0.05）。在20例人工降解险材中,核小体组STRs基因座平均检出率为64.75%,非核小体组STRs基因座平均检出率为26.75%。在被分析的10个STRs中,位于核小体组的D10S1248基因座更容易被毛细管凝胶电泳检测到（在20例人工降解检材中该基因座检出率达到了100%）。D18S51基因座是核小体组内检出率最低的一个基因座,其检出率低于60%。非核小体组内基因座检出率普遍较低,达到了10%至45%之间。在12例福尔马林固定样本中,核小体组检出率明显高于非核小体组（P=0.008<0.05）。核小体组基因座平均检出率为50%;非核小体组的平均检出率为27%。在核小体组中随着固定时间的延长检出率有明显下降的趋势,非核小体组随着固定时间的延长检出率基本无变化,但不论固定时间长短,核小体组检出率均明显高于非核小体组。在被分析的5个核小体组STRs中,4个STRs基因座（TPOX、TH01、 D10S1248、DYS391）检出率较高,可以作为第三部分复合扩增体系构建的候选基因。3第三部分结果：①筛选到2个具有法医学应用潜力的未经报道的核小体STR基因座（AC012568.7和AC007160.3）,两个基因座在河北汉族人群中的杂合度观察值分别是0.648和0.722,多态信息含量分别是0.52和0.59,个人识别能力分别为0.755和0.787,非父排除力为0.353和0.463。②成功构建了5个包含核小体STRs （TPOX, TH01, D10S1248, AC012568.7和AC007160.3）的核小体复合扩增体系。③使用核小体STR分型体系和MiniFilerTM)寸20例人工降解检材进行分析,结果显示核小体复合分型体系的平均检出率为54%;MiniFilerTM（包括所有位点）的平均检出率为19%; MiniFilerTM （< 147bp）组的平均检出率为17%。Mann-Whitney U Test分析显示核小体复合分型体系基因座平均检出率明显高于MiniFilerTM （包括所有位点）和MiniFilerTM（< 147bp）组（Pminifiler-all=0.000<0.05； Pminifiler-147=0.000< 0.05）。使用核小体STR分型体系和MiniFilerTM对12例福尔马林固定样本分析,结果显示核小体复合分型体系的平均检出率为40%; MiniFilerTM （包括所有位点）的平均检出率为11%;MiniFilerTM （<147bp）组的平均检出率为18%。Mann-Whitney U Test分析显示核小体复合分型体系基因座平均检出率明显高于MiniFilerTM （包括所有位点）和MiniFilerTM（< 147bp）组（Pminifiler-all=0.005<0.05;Pminifiler-147=0.043<0.05）。对于单个基因座检出率分析时,核小体复合扩增体系中的单个基因座检出率均高于或等于MiniFilerTM (< 147组单个基因座检出率。这一实验结果与大规模测序所获核小体复合扩增体系与MiniFilerT试剂盒中各基因座的核小体定位信息相一致。使用NuScore软件对核小体复合扩增体系与MiniFilerTM试剂盒中各基因座核小体定位信息的预测结果与之相反。结果显示MiniFilerTM （< 147bp）组各基因座核小体形成潜力高于核小体复合体系中各基因座。结果提示较软件预测方法,大规模测序技术筛选核小体核心区域遗传标记更为准确,更贴近法医学实践需求。结论：1本研究应用新一代高通量测序技术对人类血液白细胞核小体核心DNA进行测序,经过生物信息学分析,筛选出位于核小体核心区域的SNVs共2462个,Indels 128个,STRs 10167（编程筛选方法1）和295126个（编程筛选方法2）,其中包括5个法医学常用STRs （TH01, TPOX, D18S51, DYS391和D10S1248）。2该5个法医学常用核小体STR基因座对DNase肖化的降解DNA及福尔马林固的降解检材的检出成功率明显高于非核小体STR基因座,说明核小体对DNA的确具有保护作用,是用于高度降解检材DNA检验的优选遗传标记。3最后,本研究成功构建了包括5个核小体STRs （TPOX、TH01、 D10S1248、AC007160.3和AC012568.7）的复合分型体系,该复合分型体系无论对人工降解DNA还是福尔马林固定检材,均具有较高的检出率明显高于MiniFilerTM式剂盒。提示利用核小体这种保护作用研发核小体STR分型体系,可以为解决高度降解DNA分型难题提供了新思路和新策略。4通过比较大规模测序筛选结果与软件预测结果,提示较软件预测方去,大规模测序技术筛选核小体核心区域遗传标记更为准确,更贴近法医学实践需求。