前言 关节软骨组织损伤、破坏多，但其自身修复能力差。组织工程技术的兴起、发展为体外培养软骨组织提供了可能，为软骨组织的修复提供了新途径。但体外培养的软骨细胞生长缓慢，老化快，不能适应临床的需要。近年来人们发现一种叫细胞因子的物质在细胞生长、增殖、发育、代谢过程中发挥作用。通过在体外培养的软骨细胞中填加细胞因子，会加速细胞增殖，延缓衰老。 10多年前人们发现了HGF，并多用于促进肝细胞的组织修复和再生。HGF作为一种多功能因子，对多种组织、器官发挥作用。人们发现软骨细胞表达HGF受体，并对其发生反应。HGF在体内外均可调节软骨细胞的增殖和分化。外源性HGF能加强骨、软骨的形态发生，提高培养软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA的表达和碱性磷酸酶活性。HGF能明显增强损伤软骨等组织器官的修复能力。 我们在体外培养得到软骨细胞，通过免疫组化技术和Giemsa染色技术在显微镜下确定其符合软骨细胞的形态特征，并证明其具有软骨细胞所特有的分泌Ⅱ型胶原的能力。在传代细胞中加入HGF，通过、MTT技术、流式细胞仪技术验证HGF对关节软骨细胞的促增殖作用，摸索其最佳作用浓度。 实验材料 1．主要仪器：二氧化碳孵箱、超净工作台、酶联免疫检测仪、流式细胞仪、多孔培养板、倒置显微镜等。 2．主要试剂：DMEM培养基，HGF，IGF-1，rhIGF-1，PI，MTT，RNase，胎牛血清，Ⅱ型胶原抗体，胰蛋白酶。 3．实验动物：二周龄新西兰白兔，购于医大二院动物室。 实 验方 法 1．无菌条件下切取2周龄兔关节软骨，制成细胞悬液，用含FBS的DMEM培养。 2．倒置显微镜观察细胞接种后、细胞贴壁后以及细胞传代的形态。 3．细胞爬片Giemsa染色光镜观察细胞生长情况。 4．细胞爬片、甩片免疫组化法检测11型胶原表达情况。 5．细胞加生长因子培养，＊u检测了解细胞生长因子对细胞存活数的影响。 6．流式细胞仪检测细胞生长因子对软骨细胞增殖的影响。 实 验 结 果 ＊倒置显微镜下观察接种后细胞具有软骨细胞的特征，可以传代。软骨细胞第1－4代的形态变化基本上一致从后随着细胞传代次数的增多，逐渐可以见到肥大细胞增多，这种细胞很大，胞浆很多，核很小并且固缩，反光增强，见不到核分裂相。这说明软骨细胞在传代多次后增殖能力减低，成熟细胞增多，甚至接近于细胞凋亡状态。 2．Giemsa染色光镜观察见软骨细胞形态更加清楚，呈多角形，小菱形。 3．免疫组化结果说明培养的细胞具有软骨细胞的特征。 4．Mtt测定结果说明不同浓度的HGF均可以促进关节软骨细胞的增殖，而以HGF的浓度为10ngirnl时作用效果最明显。但较之mF，HGF的作用为弱，IGF的促增殖作用更明显，IGF的最佳作 ·2·用浓度为50n矿ml。 5．流式细胞仪测定结果测得的细胞周期图形使用机器自备的软件处理、分析发现，HGF和IC。F均可刺激细胞增殖。这与Mtt测定结果一致。而且HGF和IGF联合作用的增殖效果更加明显，分别优于 HGF和mF的单独作用。 讨 论 1．软骨细胞有丝分裂活动极低，其自身修复能力差。体外培养的软骨细胞增殖很有限。临床上由于外伤或疾病造成的关节软骨缺损自身很难修复。我们通过给体外培养的软骨细胞中填加HGF，使软骨细胞增殖速度加快，数据有统计学意义。细胞生长因子促进细胞增殖作用的情况，一种是促进细胞数目增加，另一种是使休眠细胞进入增殖状态。软骨细胞表达HGF受体，HGF ｛f助于一种具有酪氨酸酶活性的跨膜受体的激活来发挥其生物学效应。该受体是C－md原癌基因的表达产物，称为Met。成熟的Met受体位于细胞膜上，是由一条。链和一条p链通过二硫键连接而成的异二聚体。p链有胞外区、跨膜区和胞内区，a链只有胞外区部分，借助于二硫键附于ei链上。p和a链的胞外区是配体识别部位，可识别并结合HGF；而胞内部位具有酪氨酸激酶活性，HGF激活的Met受体发生自动磷酸化，其酪氨酸激酶活性增强，导致多种底物蛋白的酪氨酸磷酸化，继而发挥其调节细胞增殖、分化和运动的功能。HGF通过刺激细胞迁移J殖和合成蛋白多糖等多种作用，促进软骨再生。在软骨形成过程中，HGF能特异地作用于软骨细胞，对其具有趋化性和致有丝分裂活性，并促其合成基质。尽管HGF的作用比类胰岛素细胞生长因子门）弱，但在相同条件下，HGF能同时刺激软骨细胞迁移和合成蛋白多糖。HGF是目前已知的唯一的多功能因子。 ·3· 上HGF的作用存在剂量效应关系。不同浓度的HGF对关节软骨细胞增殖的促进作用不同。利用Mtt法对细胞增殖进行检测，Mtt是一种能接受氢原子的染料，活细胞线粒体的滤用脱氢酸能使外源性的Mtt还原为难溶性的蓝紫色结晶物，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。在一定细胞范围内，Mtt结晶形成的量与细胞数