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瘦素是分子量大小为16kD的蛋白分子,作为一种信号分子其主要功能是调节人体脂肪含量,同时它也具有调节生长发育,调节炎症反应、免疫功能、维持正常的血脂代谢等功能。近年来越来越多的研究资料表明,人体内的血清瘦素水平与乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、前列腺癌、脑瘤、脂肪瘤等的发生都有着一定的关系,血清瘦素水平是癌症患者的一个重要的监测指标。但瘦素对肿瘤生长的影响及其作用机制仍未阐明,瘦素对肿瘤细胞株的直接作用研究报道不多。
为了探讨瘦素对肿瘤细胞株生长增殖的影响及其作用的分子机制,本实验根据NCBI中公布的人瘦素cDNA序列,设计并合成了6个89bp左右的DNA小片断,经重叠PCR扩增获得464bp重组的人瘦素(rhLep)基因。构建pET22b(+)/rhLep表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达蛋白以包涵体的形式存在,表达量占菌体总蛋白的50%以上。表达产物经Ni2+亲和层析柱纯化后,目的蛋白的纯度均在95%以上。
MTT比色法测定不同瘦素浓度对肿瘤细胞生长增殖的影响、吖啶橙染色观察细胞核形态变化、流式细胞仪检测rhLep对不同肿瘤细胞生长周期的影响。实验发现瘦素对人胃癌MGC-803细胞最为敏感,在浓度为100ng/ml时能明显诱导人胃癌细胞MGC-803发生凋亡;对人胃癌BGC-823细胞较为敏感,在浓度为300ng/ml时能使胃癌细胞BGC-823停留在G0/G1期,阻滞细胞进入S期;但对人乳腺癌细胞株MCF-7的生长增殖无明显影响。
DNA裂解片段分析胃癌细胞MGC-803凋亡情况、AnnexinV-FITC和PI双染色检测MGC-803细胞早期凋亡,Caspase-3,8,9、线粒体细胞色素C氧化酶活性测定实验证明rhLep能够有效地抑制MGC-803细胞增殖,在培养基rhLep浓度为300ng/ml浓度下MGC-803细胞存活率仅为1.6%。DNAladder胶电泳出现凋亡特征性的“梯状条带”,rhLep能以剂量依赖性方式使得MGC-803细胞Caspase-3、8蛋白表达上调,提示Caspase-3活化介导rhLep诱导的MGC-803细胞凋亡。而MGC-803细胞caspase-9及细胞色素C的活性与对照组相比无显著差异。说明rhLep通过死亡受体途径呈剂量依赖性地抑制胃癌细胞MGC-803的增殖,并诱导细胞发生凋亡。
本文成功建立了瘦素的高效原核表达系统,研究了瘦素对不同肿瘤细胞的生长繁殖的影响,并阐明了rhLep通过死亡受体途径介导胃癌细胞MGC-803凋亡的具体分子机制。这些研究工作为进一步阐明瘦素对肿瘤生长的影响及瘦素直接作用于肿瘤的体内活性研究奠定了基础。