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研究背景:增生性瘢痕(Hypertrophic scar,HS)是机体继发于创伤、手术、皮肤疾病等引起的皮肤纤维组织过度修复的结果。HS的发生、发展过程非常复杂,具体发病机制仍未完全明确,目前尚无特效的治疗手段,且其存在高复发率的问题,是临床上面临的棘手问题。非编码RNA(non-coding RNA,nc RNA),如lncRNA和miRNA是研究的热点问题,现有研究表明nc RNA可以在表观遗传、转录和转录后过程中调控基因的表达,在肿瘤、神经退行性疾病、纤维化疾病等多种疾病中发挥着重要的调控作用。聚焦于nc RNAs与增生性瘢痕错综复杂的调控机制的研究层出不穷,越来越多的证据表明在增生性瘢痕的形成中nc RNAs起着至关重要的作用。前期我们采用基因芯片分析发现,在增生性瘢痕及正常皮肤组织来源成纤维细胞中存在着lncRNAs和m RNAs差异表达谱,其中lncRNA MALAT1和Smad泛素化调节因子2(Smurf2)在增生性瘢痕来源的成纤维细胞中高表达。我们研究团队已经证实泛素-蛋白酶体通路在增生性瘢痕中存在异常活化,其与TGF-β/Smad信号通路转导密切相关。而Smurf2可通过介导Smad7经泛素-蛋白酶体通路降解,解除Smad7对TGF-β/Smad信号通路的负反馈抑制作用。我们利用生物信息学网站预测发现lncRNA MALAT1与miR-29存在多个结合位点,同时Smurf2又是miR-29的下游靶基因。现有研究提示miR-29在增生性瘢痕中低表达并能抑制胶原等细胞外基质的合成,对抗增生性瘢痕纤维化。因此,本研究拟采用基因过表达、RNAi干扰、RT-q PCR、Western blot、双荧光素酶报告基因实验、功能回复实验以及细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡等生物学行为实验等方法,从组织和细胞水平共同探讨lncRNA MALAT1靶向miR-29调控Smurf2在增生性瘢痕形成中的作用与分子调控机制,为进一步理解增生性瘢痕的发病机制及为增生性瘢痕防治靶点选择提供新的理论依据和实验基础。第一部分LncRNA MALAT1与TGF-β/Smad信号通路相关分子在增生性瘢痕组织和细胞中的表达情况目的:明确lncRNA MALAT1与TGF-β/Smad信号通路相关分子在增生性瘢痕(HS)与正常皮肤组织(NS)以及增生性瘢痕(HSFs)和正常皮肤成纤维细胞(NSFs)中的表达情况。方法:收集行手术切除的增生性瘢痕组织和自体皮移植后剩余的正常皮肤组织标本,采用组织块贴壁法分离培养皮肤成纤维细胞;细胞免疫荧光进行成纤维细胞波形蛋白鉴定;应用HE、Masson染色检测HS和NS两者在组织病理学上的差异;采用RT-q PCR和Western Blot检测lncRNA MALAT1、TGF-β/Smad信号通路相关分子TβRI、Smad7、Smad2、Smad3及瘢痕纤维化指标α-SMA、COL1A1在HS及NS组织以及HSFs和NSFs细胞中的表达情况。结果:组织块贴壁法成功从皮肤组织中分离培养出增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞;细胞免疫荧光结果证实分离培养的细胞为成纤维细胞且纯度较高;HE、Masson染色结果显示:与正常皮肤组织相比较,增生性瘢痕皮肤组织表皮层明显角化,真皮层明显增厚,内可见毛细血管增生,成纤维细胞数目增多,大量的胶原纤维增生,呈旋涡状或不规则排列,皮脂腺、汗腺、毛囊等皮肤附属器减少或消失,病理表现符合增生性瘢痕组织的特点;结果显示:在m RNA水平,与NS和NSFs相比较,在增生性瘢痕组织和细胞中,lncRNA MALAT1、TGF-β/Smad信号通路相关分子TβRI、Smad2、Smad3以及瘢痕纤维化指标α-SMA、COL1A1均呈高表达,差异均有统计学意义(p<0.01);而TGF-β/Smad信号通路负性调控因子Smad7的表达水平无明显差异(p>0.05);Western blot结果显示:在蛋白水平上,与NS和NSFs相比较,在增生性瘢痕组织和细胞中,TGF-β/Smad信号通路相关分子TβRI、Smad2、Smad3以及瘢痕纤维化指标α-SMA、COL1A1均呈高表达,差异均有统计学意义(p<0.01);而Smad7的蛋白表达水平无明显差异(p>0.05)。结论:1、运用组织块贴壁法可成功分离培养出增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞。2、LncRNA MALAT1在增生性瘢痕组织及增生性瘢痕来源的成纤维细胞中均高表达。3、TGF-β/Smad信号通路在增生性瘢痕中存在着异常活化,促进瘢痕的形成。第二部分LncRNA MALAT1对增生性瘢痕成纤维细胞生物学行为的影响目的:探究lncRNA MALAT1对增生性瘢痕成纤维细胞生物学行为的影响。方法:构建携带lncRNA MALAT1干扰序列的慢病毒,采用慢病毒转染及嘌呤霉素筛选构建lncRNA MALAT1下调的HSFs稳转细胞株,通过RT-q PCR验证lncRNA MALAT1在HSFs中的干扰效率;分别利用CCK-8细胞增殖实验、细胞划痕实验和Transwell细胞迁移实验、Matrigel细胞侵袭实验、流式细胞术检测lncRNA MALAT1下调对HSFs增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。结果:采用慢病毒转染及嘌呤霉素筛选,成功构建lncRNA MALAT1下调的HSFs稳转细胞株;CCK-8细胞增殖实验结果显示:与blank及sh-NC组相比,lncRNA MALAT1干扰组细胞增殖能力受到抑制,差异有统计学意义(p<0.05);细胞划痕实验结果显示:与blank及sh-NC组相比,lncRNA MALAT1干扰组细胞迁移能力受到抑制;Transwell细胞迁移实验结果显示:与blank及sh-NC组相比,lncRNA MALAT1干扰组细胞迁移能力明显受到抑制,差异具有显著统计学意义(p<0.001);Matrigel细胞侵袭实验结果显示:与blank及sh-NC组相比,lncRNA MALAT1干扰组细胞侵袭能力明显受到抑制,差异具有显著统计学意义(p<0.001);流式细胞术结果显示:与blank及sh-NC组相比,lncRNA MALAT1干扰组细胞凋亡率增加,差异具有显著统计学意义(p<0.001)。结论:1.成功构建了lncRNA MALAT1干扰慢病毒增生性瘢痕成纤维细胞稳转细胞株。2.LncRNA MALAT1可促进增生性瘢痕成纤维细胞增殖,增强细胞迁移和侵袭的能力,抑制细胞凋亡。第三部分LncRNA MALAT1靶向miR-29调控Smurf2在增生性瘢痕形成中的具体作用与分子机制目的:探讨lncRNA MALAT1靶向miR-29调控Smurf2在增生性瘢痕形成中的具体作用与分子机制。方法:采用RT-q PCR和Western blot实验分别检测增生性瘢痕和正常皮肤组织以及HSFs和NSFs中miR-29、Smurf2的表达情况,并且进行pearson相关分析验证lncRNA MALAT1、miR-29与Smurf2三者在增生性瘢痕组织中表达的相关性;运用在线网站预测并经双荧光素酶报告基因实验验证lncRNA MALAT1与miR-29以及miR-29与Smurf2之间的靶向结合关系;在增生性瘢痕成纤维细胞中,通过慢病毒或si RNA进行细胞转染,对lncRNA MALAT1、miR-29与Smurf2进行沉默或过表达,并设计rescue功能回复实验,采用RT-q PCR检测细胞中lncRNA MALAT1、miR-29、Smurf2与TGF-β/Smad信号通路相关分子m RNA的表达情况,Western blot检测细胞中Smurf2与TGF-β/Smad信号通路相关分子的蛋白表达水平,并利用功能表型实验检测细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡的变化,系统观察lncRNA MALAT1靶向miR-29调控Smurf2在增生性瘢痕形成中的作用与分子调控机制。结果:RT-q PCR和Western blot实验结果显示:相较于正常皮肤组织和正常皮肤成纤维细胞,miR-29在增生性瘢痕组织及增生性瘢痕成纤维细胞中低表达,而Smurf2呈高表达,差异均有统计学意义(p<0.05);Pearson相关分析结果显示:在增生性瘢痕组织中,lncRNA MALAT1与miR-29以及miR-29与Smurf2表达呈负相关;双荧光素酶报告基因实验明确miR-29a-3p可以同时与lncRNA MALAT1和Smurf2靶向结合;下调lncRNA MALAT1可以增加miR-29的表达,而降低Smurf2的表达水平;下调lncRNA MALAT1可以抑制TGF-β/Smad信号通路转导、抑制胶原等细胞外基质的形成;miR-29可通过下调Smurf2表达,抑制TGF-β/Smad信号通路转导、抑制胶原的合成,抑制细胞增殖、迁移、侵袭,促进细胞凋亡;Rescue回复实验发现miR-29和Smurf2可以部分回复lncRNA MALAT1敲减对增生性瘢痕成纤维细胞增殖、迁移、侵袭能力的抑制作用。结论:1、下调lncRNA MALAT1表达后miR-29表达增加,而Smurf2表达下调,TGF-β/Smad信号通路受到抑制。2、miR-29a-3p与lncRNA MALAT1和Smurf2均存在靶向结合。3、miR-29a-3p可通过靶向Smurf2抑制TGF-β/Smad信号通路活化,从而抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖、迁移、侵袭,促进细胞凋亡。4、LncRNA MALAT1靶向miR-29a-3p/Smurf2轴激活TGF-β/Smad信号通路,促进增生性瘢痕的形成。