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具有刺激免疫应答的药物—免疫增强剂的应用,在生产中对动物传染性疾病具有提高免疫功能,并由此增强抵抗能力的重要作用。然而,现在最常用的免疫增强剂大多是化学合成的,在药物残留方面具有潜在的隐患。如今药物的安全性引起了公众的关注,从而使得中药显示出其优越性。许多研究表明,多糖是中药的一个重要组成部分,是存在于天然植物,微生物(细菌和真菌)和海藻类生物体内的一类复杂的天然高分子化合物。许多药理和临床研究表明,多糖具有增强免疫,抗病毒,抗肿瘤,抗氧化,抗衰老等生物活性。本研究从玉屏风散整体出发追踪其多糖类活性成分,然后与方中的单味药白术多糖作比较,通过体内外实验探究玉屏风多糖的免疫增强活性。首先用一步醇沉和分级醇沉法提取玉屏风总多糖和白术总多糖及各分级多糖,通过体外对鸡外周血淋巴细胞增殖的影响,筛选出3个效果较好的活性部位;然后从体外对鸡淋巴细胞周期分布和淋巴细胞亚群CD4+/CD8+比例的影响,体内对鸡新城疫疫苗免疫应答的影响,比较了3个多糖的增强免疫活性。实验分为以下五个部分:采用一步醇沉和分步醇沉法提取粗的玉屏风总多糖(YPF-PStc)和白术总多糖(RAMPStc),3个分级白术多糖RAMPS60c、RAMPS70c和RAMPS80c。YPF-PStc和RAMPStc通过阴离子交换剂DEAE sephadex A-25分离纯化,从中分离出纯化的玉屏风多糖(YPF-PStp)和白术多糖(RAMPStp),分别用苯酚-硫酸法和考马斯亮兰法测定多糖和蛋白含量,红外质谱法鉴定多糖的结构。结果显示,YPF-PStc提取率为13.56%,RAMPStc提取率为13.36%,分级白术多糖的提取率以RAMPS60c最高、达14.79%;YPF-PStp提取率为16.87%。RAMPStp的糖含量最高、达97.14%,比RAMPStc提高了9.93%,YPF-PStp的糖含量为85.6%,比YPF-PStc提高了18.25%;玉屏风和白术各多糖的蛋白含量都较低。结果表明,柱层析纯化后可以提高多糖的糖含量,多糖都具有糖的典型特征吸收峰。将YPF-PStc、YPF-PStp、RAMPStc、RAMPStp和RAMPS60c、RAMPS70c、RAMPS80c加入到鸡外周血淋巴细胞培养体系中,用MTT法测定其安全浓度;然后将安全浓度下的7种多糖,分别单独或协同PHA加入到培养的鸡外周血淋巴细胞中,培养48 h后,测定淋巴细胞增殖(细胞A570值和最高淋巴细胞增殖率)的变化。结果表明,多糖单独刺激时YPF-PStc和RAMPStp在15.625~62.5μg m L-1、YPF-PStp在7.813~62.5μg mL-1、RAMPS70c在31.25μg m L-1时能显著促进淋巴细胞增殖,YPF-PStp在31.25μg m L-1时的细胞增殖率最高,为31.148%;多糖与pha共同刺激时,ypf-pstc在15.625~62.5μgml-1、ypf-pstp在15.625~31.25μgml-1、ramps60c在0.781~1.563μgml-1、rampstp在3.125μgml-1能显著促进淋巴细胞增殖,ramps60c在7.813μgml-1时的细胞增殖率最高,为29.897%。综合评价,筛选出ypf-pstp、rampstp和ramps60c可能是增强免疫活性的较好部位。多糖ypf-pstp、rampstp和ramps60c在31.25μgml-1(细胞增殖试验筛选出的最佳浓度)时刺激淋巴细胞,分别在24h、48h和72h收集细胞,经过处理,在流式细胞仪上检测各个时间点的周期分布情况。结果显示,在72h之内未经任何处理的细胞大部分处于g0/g1期,其变化不明显。与空白组比较,pha组位于g0/g1期细胞的百分比明显降低(p<0.05),处于s期和g2/m期的细胞百分比明显增多(p<0.05)。在不同时间点,ypf-pstp、rampstp和ramps60c与pha组相比,都可以明显降低g0/g1期细胞的百分比(p<0.05),ypf-pstp和rampstp在作用于淋巴细胞48h时明显升高s期细胞的百分比,其spf值、pi值均最大,效果最明显。分别在24h、48h和72h收集细胞,pbs洗涤2次,流式细胞仪检测cd4+、cd8+t淋巴细胞亚群的变化。结果显示,在所有时间点,试验组的cd4+淋巴细胞百分率均显著高于pha对照组(p<0.05),ypf-pstp和rampstp处理细胞48h后,cd4+淋巴细胞百分率显著高于ramps60c对照组(p<0.05)。多糖处理细胞48h、72h后,cd8+淋巴细胞百分率和cd4+/cd8+比值均显著高于pha对照组(p<0.05),ypf-pstp和rampstp处理细胞48h后,cd8+淋巴细胞百分率显著高于ramps60c对照组(p<0.05),表明ypf-pstp和rampstp可以明显提高cd4+、cd8+淋巴细胞百分率及cd4+/cd8+比值。为了比较上述3个多糖的增强免疫作用,测定了3个多糖对雏鸡新城疫疫苗免疫效果的影响。将健康1日龄海兰褐雏公鸡210只,随机分为6组,除空白对照组外,14日龄雏鸡均用新城疫iv系苗滴鼻点眼免疫,28日龄二免。在首次免疫的同时,分别肌肉注射6mgml-1的ypf-pstp、rampstp和ramps60c,口服10mgkg-1的盐酸左旋咪唑,无佐剂对照组注射等量生理盐水。分别于首次免疫后第7、14、21、28d翼静脉采血检测血清hi抗体效价,心脏采血测定外周血t淋巴细胞增殖、淋巴细胞周期和cd4+、cd8+t淋巴细胞亚群的变化,处死雏鸡后称取体重及胸腺、脾脏和法氏囊的重量,计算免疫器官指数。结果表明,ypf-pstp和rampstp在大多时间点能显著提高血清抗体效价、促进t淋巴细胞增殖、促进淋巴细胞进入s期和g2/m期,提高cd4+、cd8+t淋巴细胞亚群的百分率,提高雏鸡免疫器官指数。其中YPF-PStp免疫增强活性最强。