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目的:克隆胃癌特异性幽门螺杆菌(H.pylori)的cagA基因片段,建立原核表达系统,鉴定重组表达产物的免疫原性。为临床胃癌相关H.pylori菌株筛选和针对性治疗奠定基础。
方法:选取前期研究确定的可能与胃癌相关的第6型菌株eagA基因片段,在GenBank中确定为AAG09884,优化设计并合成cagA基因。并在该基因两端分别添加内切酶位点,将合成的cagA基因从put57-CagA质粒中切出,用表达载体pET32a携带该基因转化宿主菌BL21(DE3),通过氨卞青霉素抗性筛选和菌落PCR挑选出阳性克隆pET32a-cagA。以IPTG诱导含pET32a-CagA的宿主菌表达融合蛋白,经SDS-PAGE凝胶电泳分析CagA蛋白表达情况,用Western-blot鉴定融合蛋白的抗原性。
结果:
1.靶基因合成:设计并人工合成了cagA基因片段(AAG09884),该基因长度为678bp,编码228个氨基酸。序列测定结果显示,合成的cagA基因序列与设计的序列完全一致。
2.成功构建pET32a-CagA原核表达质粒,其目的cagA基因的测序结果与设计的序列同源性为100%,对应蛋白序列同源性100%。
3.含pET32a-cagA的BL21(DE3)宿主菌经IPTG诱导后能表达出CagA融合蛋白,经SDS-PAGE凝胶电泳分析结果表明,融合蛋白分子量大小与预期相一致(45KD)。
4.Western-blot检测结果显示该融合蛋白可与抗H.pylori全菌抗体结合反应。
结论:
1.成功合成H.pylori菌株cagA基因片段,经测序分析其氨基酸序列与GenBank上AAG09884的同源性达100%。
2.成功构建原核表达质粒pET32a-cagA,经IPGT诱导转化宿主菌,获得分子量约45KD的CagA融合蛋白,且此蛋白具有CagA蛋白的抗原性。