背景:百草枯(PQ)为一种速效触杀灭生型季胺盐类除草剂,其化学名为1-1’-二甲基-4-4联吡啶阳离子盐。我国既是百草枯的生产大国,又是百草枯的消费大国。随着百草枯的广泛使用,百草枯中毒患者也日益增多。百草枯脂溶性强,易于人体吸收,且在血液中基本不与血浆蛋白结合,故进入人体后可迅速分布于肺、肝、肾和肌肉等组织器官中。其中肺组织既是百草枯在人体的主要蓄积器官,也是百草枯致人体损伤的主要靶器官。在百草枯中毒早期可发生急性肺损伤,到了中晚期则以肺纤维化为主要表现,典型百草枯中毒患者的肺也被称为“百草枯”肺。近几十年来,国内外学者对百草枯的发病机制进行了大量研究,也取得一些进展,但对于百草枯中毒的具体发病机制仍未完全阐明,故百草枯中毒,尤其是中重度中毒患者死亡率极高,临床尚无特效解毒药及救治方法。因此有必要进一步研究百草枯中毒的发病机制,尤其是在分子与基因水平的研究,为百草枯中毒的治疗带来突破性进展。20世纪90年代,有学者在对果蝇的研究中发现一种新的信号通路即Hippo信号通路,目前已证实该通路参与了细胞增殖、分化和凋亡,在肿瘤的发生过程中起着重要作用。随着对Hippo通路研究的深入,人们发现该通路与人类的其他疾病如主动脉瘤、组织纤维化、病毒性肝炎等的发生密切相关。近年来研究发现Hippo信号通路和TGF-β 1信号通路在调节结缔组织生长因子(CTGF)的表达方面存在着交互作用,而TGF-β1已被认为是百草枯中毒中引起肺纤维化的关键因子。因此,Hippo信号通路可能在百草枯中毒致肺纤维化的发病过程中起着重要作用。在本研究中我们首次通过观察百草枯染毒大鼠肺组织内MST、Yap、TGF-β 1及Smads等细胞因子的变化情况,了解Hippo信号通路在百草枯中毒致肺纤维化中的作用,为深入开展百草枯中毒发病机制的研究开辟新的思路。中药红花是一种具有活血化瘀作用的常用药物,自汉代以来广泛应用于临床。红花黄色素为红花的提取物,其中85%以上为羟基红花黄色素A(HSYA),临床上常用于各种缺血性心脑血管疾病的治疗,其安全性及有效性已得到证实。近年来随着研究的深入,人们发现红花黄色素还具有抗血栓、抗氧化、抗炎、抗纤维化等多种药理作用。已有实验证实红花黄色素能抑制博来霉素诱导的小鼠及大鼠肺纤维化,同时在临床上使用红花黄色素治疗IPF也取得了一定的效果。目前临床上对百草枯患者主要以大剂量糖皮质激素作为基本的抗炎及抗纤维化治疗手段,不仅效果尚不理想,而且副作用较大,因此发现新的且副作用较小的治疗药物具有重要意义。本研究中我使用红花黄色素及TGF-β 1抑制剂SB431542干预百草枯染毒大鼠,通过观察其肺组织病理学与部分蛋白分子表达水平的变化为百草枯中毒的临床治疗研究探索新的方向,提供一定的理论基础。目的:1、建立急性大鼠百草枯中毒肺纤维化模型,研究Hippo信号通路在其发病机制中的作用;2、从Hippo信号通路角度出发探索红花黄色素及TGF-β 1抑制剂SB431542治疗百草枯肺纤维化的分子机制,为药物的临床使用提供理论基础。方法:选取成年(6周)雄性Wister大鼠255只,随机分为6组,其中空白对照组、SY对照组及SB对照组各35只,染毒组、SY干预组及SB干预组各50只。染毒组、SY干预组及SB干预组以50mg/kg给予体积分数为20%的百草枯原液加生理盐水稀释至1ml灌胃;空白对照组、SY对照组及SB对照组与其等量生理盐水灌胃。SY干预组给予红花黄色素50mg/kg,SB干预组给予SB431542 100μg/kg,每日腹腔注射,其余各组给予等量生理盐水每日腹腔注射,连续给药四周。各实验组于实验开始后3、7、14、21、28天各处死6只大鼠。留取大鼠血液ELISA法检测血清TGF-β1浓度。留取大鼠肺组织分别使用荧光实时定量PCR检测肺组织MST、TGF-β1、Yap、Smad3、CTGFmRNA的表达;免疫荧光检测肺组织MST、TGF-β1、Yap、Smad3、CTGF蛋白的表达及定位;Western-blotting检测肺组织MST、TGF-β1、Yap、Smad3、CTGF蛋白的表达。留取大鼠肺组织病理切片行HE及Masson染色后,光学显微镜下观察组织病理改变,并进行病理学评分。留取大鼠肺组织透射电镜观察组织超微结构的变化情况。计算各实验组不同时间点生存率,用Kaplan-Meier方法比较各组生存率。结果:1.血清TGF-β,水平染毒组大鼠血清TGF-β1浓度自3天开始进行性升高,14天达到高峰,其后缓慢下降,28天仍高于对照组。SY干预组和SB干预组与染毒组有相同变化趋势,但TGF-β1升高程度较染毒组低,差异有统计学意义(p<0.05)。空白对照组、SY对照组及SB对照组TGF-β1浓度变化无统计学差异(p>0.05)。2.肺组织MST、TGF-β1、Yap、Smad3、CTGF蛋白表达情况(1)MST染毒组MST的表达3天开始下降,7天下降到最低值,其后缓慢升高,至28天仍低于对照组。SY干预组和SB干预组与染毒组有相同变化趋势,但其下降幅度要低于染毒组,差异有统计学意义(p<0.05)。空白对照组、SY对照组及SB对照组MST的表达各组间及时间点无明显变化(p>0.05)。MST蛋白主要表达定位于肺组织细胞胞浆中,仅在处于最强表达时细胞核中出现极少量表达。(2)TGF-β 1和Smad3 染毒组TGF-β 1和Smad3的表达3天开始进行性升高,14天达到高峰,其后缓慢下降,28天仍处于较高水平。SY干预组和SB干预组与染毒组有相同变化趋势,但其升高程度较染毒组低,差异有统计学意义(p<0.05)。空白对照组、SY对照组及SB对照组TGF-β,和Smad3的表达各组间及时间点无明显变化(p>0.05)。TGF-β1蛋白表达定位于肺组织细胞胞浆中;Smad3在各对照组主要表达定位于肺组织细胞胞浆中,染毒后Smad3表达部位由胞浆转移至胞核。(3)Yap和CTGF染毒组Yap和CTGF的表达自3天起进行性升高,28天达到最高峰。SY干预组和SB干预组与染毒组有相同变化趋势,但其升高程度较染毒组低,差异有统计学意义(p<0.05)。空白对照组、SY对照组及SB对照组Yap和CTGF的表达各组间及时间点无明显变化(p>0.05)。Yap在各对照组主要表达定位于肺组织细胞胞浆中,染毒后Yap表达部位由胞浆转移至胞核;CTGF蛋白表达定位于肺组织细胞胞浆中。3.病理学变化(1)光镜观察空白对照组、SY对照组及SB对照组各时间点肺组织结构清晰完整,未见明显异常。染毒组早期表现为急性肺泡炎,肺组织充血水肿,炎性细胞浸润,基本无纤维化表现。随时间炎症表现逐渐加重,14天达到高峰,并开始出现纤维化表现。21至28天肺组织炎症表现逐渐减轻,但纤维化持续进展加重。SY干预组和SB干预组与染毒组有相同病理学变化趋势,但炎症及纤维化表现较染毒组减轻。(2)病理学评分空白对照组、SY对照组及SB对照组各时间点肺组织病理学评分无统计学差异(p>0.05)。染毒组、SY干预组及SB干预组各时间点肺组织病理学评分均明显高于空白对照组(p<0.05)。染毒组各时间点肺组织病理学评分高于SY干预组及SB干预组(p<0.05)。(3)电镜观察空白对照组、SY对照组及SB对照组各时间点肺组织超微结构基本正常,未见明显损伤。染毒组早期表现为Ⅰ、Ⅱ肺泡上皮细胞变性,线粒体肿胀,染色质边集等细胞损伤表现,晚期出现成纤维细胞增殖及胶原纤维过度增生等纤维化表现。SY干预组和SB干预组各时间点与染毒组有类似超微结构改变,但细胞损伤及组织纤维化程度较轻。4.各实验组生存率比较空白对照组、SY对照组及SB对照组大鼠生存率无统计学差异(p>0.05)。空白对照组大鼠生存率明显高于染毒组、SY干预组及SB干预组(p<0.05)。SY干预组及SB干预组大鼠生存率高于染毒组(p<0.05)。结论:1.急性百草枯中毒时Hippo信号通路可通过MST-Yap途径被激活,并通过参与TGF-β1/Smad信号通路对CTGF表达调控促进大鼠肺纤维化的发生。2.红花黄色素及TGF-β 1抑制剂SB431542能通过干预Hippo信号通路部分减轻急性百草枯中毒大鼠肺纤维化程度。3.急性百草枯中毒时,机体可能还存在不依赖于TGF-β 1信号通路的其他途径参与大鼠肺纤维化的发生。