第一部分：Sestrin2在结直肠癌中的表达及临床意义　　目的：研究检测了sestrin2在人CRC组织和细胞株中的表达，同时分析sestrin2表达水平与患者临床病理特征、生存时间之间的相关性，以探讨其在CRC发生及发展中的可能作用。　　方法：　　1.免疫组织化学方法检测sestrin2在237例CRC患者及对照组32例正常结肠粘膜、22例结肠息肉、30例结肠腺瘤、26例结肠癌癌旁组织标本中的表达情况，分析sestrin2异常表达与CRC患者临床病理特征之间的关系。　　2.免疫印迹方法及荧光定量PCR分别检测sestrin2在42例CRC患者及对照组19例正常结肠粘膜、20例结肠息肉、22例结肠腺瘤、26例结肠癌癌旁组织新鲜标本中的蛋白和mRNA表达水平，并分析sestrin2蛋白异常表达与临床病理特征之间的关系。　　3.采用Kaplan-Meier生存分析研究sestrin2表达水平与CRC患者总体生存率/无病生存率（OS/DFS）的关系，采用Cox回归方法分析CRC患者的生存时间和影响生存时间的多种相关因素之间的关系。　　4.免疫荧光及免疫印迹检测sestrin2在CRC细胞株HT-29、SW480、SW620、LoVo与正常结肠粘膜细胞株FHC的表达情况。　　结果：　　1. Sestrin2的表达主要位于细胞浆,在CRC组织中的表达阳性率为27.8％，在正常结肠粘膜、结肠息肉、结肠腺瘤及结肠癌癌旁组织中阳性率分别为87.5%、71.8%、80%和80.8%，Sestrin2在CRC组织中的表达显著低于结肠非癌对照组(p<0.05)。sestrin2的低表达与CRC的TNM分期、淋巴结浸润、淋巴结转移、血管侵袭及肝脏转移相关(p<0.05)。　　2. Sestrin2 mRNA和蛋白表达水平在CRC组中均显著低于对照组（p<0.05）,sestrin2蛋白的低表达与CRC的TNM分期、淋巴结浸润、淋巴结转移、血管侵袭及肝脏转移相关（p<0.05）。　　3.生存分析显示sestrin2高表达的CRC患者总生存时间（OS）和无病生存时间（DFS）均显著长于sestrin2低表达的CRC患者（p<0.05）。Sestrin2低表达与CRC不良预后相关（p<0.05），而且是CRC患者不良预后的独立因素（p<0.05）。　　4. Sestrin2的免疫荧光染色定位于细胞浆，在FHC细胞株中呈强表达，在HT-29和SW480细胞株中为中等表达，而在SW620和LoVo细胞株中为弱表达。　　5.与FHC细胞株相比较，sestrin2蛋白在HT-29、SW480、SW620以及LoVo中表达均显著降低（p<0.05）。此外，sestrin2在SW620及LoVo细胞中的表达显著低于HT-29和SW480（p<0.05）。　　结论：与正常结肠粘膜、结肠息肉、结肠腺瘤及结肠癌癌旁组织相比，sestrin2在人CRC组织中呈低表达。与结肠正常粘膜FHC细胞比较，sestrin2在CRC细胞株HT-29、SW480、SW620以及LoVo中表达均显著降低。此外，sestrin2低表达与临床不良预后相关，是CRC的一个独立预后因素。　　第二部分：Sestrin2过表达对结直肠癌增殖和凋亡的影响　　目的：构建sestrin2过表达慢病毒载体，观察sestrin2基因过表达后CRC细胞增殖和凋亡的变化，并探讨其可能作用机制。　　方法：　　1.构建sestrin2过表达慢病毒载体，分别转染CRC SW620、LoVo细胞，运用荧光定量PCR和免疫印迹方法验证各组细胞转染后sestrin2过表达效率。　　2.通过CCK-8法、细胞平板克隆实验和流式细胞术分别检测sestrin2基因过表达后CRC SW620和LoVo细胞的增殖和凋亡的变化情况。　　3.免疫印迹方法检测sestrin2在CRC SW620细胞中过表达对增殖、凋亡相关因子及信号传导通路相关的蛋白表达水平的影响。　　4. CRC SW620和LoVo细胞按不同干预方式分为LV-NC+ DMSO组，LV-NC+Compound C（AMPKα1阻断剂）组，LV-sestrin2+DMSO组以及LV-sestrin2+Compound C组，用CCK8法、流式细胞术检测以上四组细胞增殖及凋亡情况。　　5.在LV-NC组、LV-NC+ Compound C组、LV-sestrin2组以及LV-sestrin2+Compound C四组CRC SW620细胞中，用免疫印迹方法检测增殖、凋亡相关蛋白表达。　　6. CRC SW620细胞接种裸小鼠后，观察sestrin2过表达对CRC SW620细胞移植瘤生长的影响。　　结果：　　1.与空白对照组（BC）和阴性对照组（LV-NC）相比，转染过表达sestrin2慢病毒组（LV-sestrin2）中CRC SW620、LoVo细胞sestrin2 mRNA和蛋白表达水平均明显增加（p<0.05）。　　2.在CRC SW620、LoVo细胞中，与BC组和LV-NC组相比， LV-sestrin2组中细胞增殖能力明显减弱、克隆形成数目明显减少（p<0.05），而凋亡率明显增加（p<0.05）。　　3.在CRC SW620细胞中，与BC组和LV-NC组相比，LV-sestrin2组中增殖效应蛋白 PCNA和凋亡抑制蛋白 survivin表达显著降低（p<0.05）,而凋亡效应蛋白caspase3、caspase7和caspase9表达显著增高（p<0.05）。此外，LV-sestrin2组p-AMPKα1显著增高(P<0.05)，而mTOR信号通路的p-mTOR、p-p70s6K则显著降低(P<0.05)。　　4.在CRC SW620、LoVo细胞中，与未干预组相比较，LV-sestrin2干预组中细胞存活率显著降低、凋亡率显著升高（ p<0.05），而Compound C干预组及LV-sestrin2+Compound C干预组中细胞存活率和凋亡率均无明显变化（p>0.05）。　　5.在CRC SW620细胞中，与未干预组相比较，LV-sestrin2干预组中 p-mTOR、p-p70s6K和 survivin蛋白均显著降低（p<0.05），而Compound C干预组及LV-sestrin2+Compound C干预组中上述蛋白均无明显变化（p>0.05）。　　6.与LV-NC组相比，LV-sestrin2组裸鼠移植瘤生长速度减慢，瘤体重量显著减小（p<0.05），且sestrin2蛋白增高。　　结论：Sestrin2过表达能够抑制CRC SW620、LoVo细胞的增殖和促进结肠癌细胞凋亡，抑制结肠癌皮下移植瘤生长。Sestrin2抑制结肠癌生长的作用可能与AMPK/mTOR/Survivin相关信号通路有关。　　第三部分：Sestrin2过表达对结直肠癌侵袭转移的影响　　目的：观察sestrin2基因过表达后对结肠癌转移的影响，并探讨其可能作用机制。　　方法：　　1. Sestrin2过表达慢病毒转染SW620、LoVo细胞后，运用Transwell小室检测细胞迁移、侵袭、粘附能力的细胞行为学。　　2.免疫印迹方法检测sestrin2过表达后CRC SW620细胞中与侵袭相关的MMP2、MMP9、MMP14，与EMT（上皮间质化）相关的E-cadherin、N-cadherin、vimentin以及p-P38、smad4的蛋白表达。　　3. CRC SW620和LoVo细胞按不同干预方式分为LV-NC+ DMSO组，LV-NC+ SB202190（p38 MAPK通路阻断剂）组，LV-sestrin2+DMSO组以及LV-sestrin2+SB202190组，用Transwell小室检测以上四组细胞迁移、侵袭、粘附能力的细胞行为学变化。　　4.在LV-NC组、LV-NC+SB202190组、LV-sestrin2组以及LV-sestrin2+SB202190四组CRC SW620细胞中，用免疫印迹方法检测侵袭、EMT相关蛋白水平变化的影响。　　5.免疫组化方法检测裸鼠移植瘤移中侵袭、EMT相关蛋白表达变化。　　6.建立裸鼠CRC血道转移模型，利用小动物活体成像系统检测过表达sestrin2基因对CRC肝脏和肺转移灶形成的影响。　　结果：　　1.与空白对照组（BC）和阴性对照组（LV-NC）相比，转染过表达sestrin2慢病毒组（LV-sestrin2）的CRC SW620和LoVo细胞株中细胞迁移数目、侵袭数目以及粘附吸光度值均显著降低（p<0.05）。　　2.在CRC SW620细胞中，免疫印迹检测结果示，与BC组和LV-NC组相比，LV-sestrin2组中MMP2、MMP9以及N-cadherin均显著降低（p<0.05）, E-cadherin显著增高（p<0.05），而MMP14和vimentin无明显变化（p>0.05）。此外，LV-sestrin2组中，p-p38MAPK蛋白显著增高（p<0.05），smad4总蛋白无明显变化（p>0.05），但是smad4在细胞核中的表达显著降低（p<0.05）。　　3.在CRC SW620和LoVo细胞中，与LV-NC+ DMSO组相比较， LV-sestrin2+ DMSO组细胞的迁移数目、侵袭数目以及粘附吸光度值显著降低（p<0.05）。而LV-NC+SB202190组及LV-sestrin2+SB202190组细胞的迁移数目、侵袭数目以及粘附吸光度值均较LV-NC+ DMSO组无明显改变（p>0.05）。　　4.在CRC SW620细胞中，与未干预组相比较，LV-sestrin2干预组中 MMP2、MMP9和核smad4蛋白均显著降低（p<0.05），E-cadherin显著增高（p<0.05）。而SB202190干预组及LV-sestrin2+SB202190干预组中上述蛋白均无明显变化（p>0.05）。　　5.在裸鼠移植瘤中，与LV-NC组相比较，LV-sestrin2组中sestrin2和E-cadherin免疫组化平均光密度值（MOD值）显著增高（p<0.05）， MMP2、MMP9和N-cadherin的MOD值显著降低（p<0.05），MMP14、vimentin蛋白的MOD值无明显改变（p>0.05）。　　6.小动物活体成像系统结果显示，LV-sestrin2组中肝脏转移灶和肺转移灶的绿色荧光强度较LV-NC组显著减弱（p<0.05）。　　结论：Sestrin2过表达能够抑制CRC细胞的迁移、侵袭、粘附以及结肠癌细胞EMT，其作用可能与p38 MAPK/smad4相关信号通路有关。