研究背景 血管生成是肿瘤发展、转移的重要条件，也是所有肿瘤的共性。实体瘤形成之初尚无血管生成，此时肿瘤细胞的营养主要通过弥散获得，当细胞距离毛细血管200um以上时，氧气将无法通过弥散作用抵达肿瘤细胞，此时如再无新生血管的生成，肿瘤组织将发生退化，而若有新生血管长入肿瘤组织，肿瘤将迅速生长，并且其浸润和转移能力也大大增强。研究证实通过抑制肿瘤血管内皮细胞的生长，可达到抑制肿瘤血管生成和诱导肿瘤细胞凋亡的目的。抗血管生成治疗以其广谱、低毒、无抗药性受到了广泛关注，特别是内源性血管抑制药物的发现，掀起了抗血管生成研究的高潮。内皮抑素是新近发现的一种内源性抗血管生成药物，蛋白治疗可完全抑制动物肿瘤生长和抑制肿瘤转移，是现今发现的抗血管生成作用最强大的药物之一。由于其需要长期应用，体外不稳定，大量生产困难等因素限制了其更广泛的应用。基因治疗提供了一种替代途径可解决上述问题，而腺病毒是目前应用最广泛的载体之一。如能将两者结合起来，构建一种高效表达内皮抑素的腺病毒载体，必将能产生较好的治疗效果。 研究目的： 一．构建含全长小鼠内皮抑素基因的增殖缺陷型腺病毒表达载体。 二．观测腺病毒载体介导的内皮抑素的体外表达及检测其生物学活性，并进一步探讨其作用机理。 三．观测内皮抑素腺病毒载体体内表达及其对小鼠皮下种植肺肿瘤的治疗作用和治疗后对肿瘤血管密度的影响。 研究内容和方法： 一．内皮抑素腺病毒表达载体的构建：用细胞内同源重组的方法产生带全长内皮抑素基因的增殖缺陷型腺病毒载体，在其5’端引入成瘤蛋白信号肽以产生分泌型内皮抑素蛋白。在293细胞内扩增病毒，CsCl密度梯度浓缩及50％组织培养布二二门阵医，号学俘创匕攀七比论文中文按要脚护乞外料学专习匕 感染剂量法测定病毒滴度。二.荧光显微镜观察腺病毒载体细胞转染效率，用Rl’- PCR法检测体外腺病毒载体 转染肿瘤细胞和内皮细胞后在mRNA水平的表达，用W七stem Blot法检测腺病 毒载体转染肿瘤细胞和内皮细胞后体外培养上清中蛋白的表达并进一步用 EUSA法测定其表达水平。三.用MT’T法检测转染内皮抑素腺病毒载体后对细胞增殖率变化，用流式细胞术 检测内皮抑素腺病毒表达载体对细胞周期影响和凋亡变化，并进一步用 AnnexinV一FITC法检测早期凋亡变化。四.2xl护个Lewis肿瘤细胞小鼠背部皮下注射建立肺癌异位种植瘤模型。内皮抑 素腺病毒载体瘤内注射治疗，免疫组化检测内皮抑素蛋白肿瘤内原位表达， Westem Blot观测注射后蛋白表达持续时间，ELISA法检测血循环中内皮抑素 蛋白表达水平。五.观察内皮抑素腺病毒载体注射后对小鼠肿瘤生长和转移的影响，生存率变化。 应用CD31和CD105两种抗原标记免疫组化作肿瘤血管密度计数，观察治疗后 肿瘤血管密度变化，电镜观察肿瘤细胞凋亡情况并分析内皮抑素抗肿瘤的机 理。研究借果:一成功构建了含全长内皮抑素基因的腺病毒表达载体Ad一mEnd。，病毒扩增 后cscl密度梯度浓缩后滴度达9.2 xlo’‘。二.腺病毒载体可有效转染肿瘤和内皮细胞。Ad一mEndo转染Lewis肿瘤细胞 和ECV304内皮细胞后应用Rl’- PCR法均检测到了内皮抑素mRNA表达，转 染后的培养液上清中W七stem Blot法检测到了内皮抑素蛋白表达，EUSA法 测定Ad一mEnd。转染Lewis肿瘤细胞后培养上清中内皮抑素蛋白浓度可达 3275士505ng/ml。三.内皮抑素可明显抑制ECV304内皮细胞的增殖(P<0.05)，对Lewis肿瘤细胞 影响不大(P>0.05)。内皮抑素可阻断vEGF;65对ECv304细胞的生长促进作 用。内皮抑素可使ECV304细胞G:期阻滞并能诱导内皮细胞凋亡。四.应用小鼠背部皮下注射成功建立肺癌异位种植瘤模型，成瘤率100%。内皮甫二二军医大学俘创匕掌位论文中文摘要脚护乞外料学专业抑素腺病毒载体瘤内注射后可明显抑制肿瘤生长和转移、延长小鼠生存期。内皮抑素腺病毒载体注射后免疫组化示肿瘤组织内内皮抑素强阳性表达，对照组阴性或痕量表达。内皮抑素表达可持续一个月，第二周血循环浓度可达1 540士56on留ml。免疫组化显示治疗组肿瘤组织内皮抑素蛋白强阳性表达，对照组阴性或痕量表达。ELISA检测治疗组血清内皮抑素浓度，第二周可达1540士56on岁ml，一月后降至对照水平。治疗组肿瘤体积，生存率与空载体对照及阴性对照组相比有显著性差异(P<0.05)，CD105标记的肿瘤内新生血管密度在治疗组、空载体对照组和阴性对照组分别为10.5士3.2，39.7士5.6，42.4士4.8个/200倍视野，前者与后两者相比有非常显著差异(P<0.01)。电镜示治疗后的肿瘤组织内凋亡肿瘤细胞多见。实脸诺论:一构建的内皮抑素腺病毒载体可在体内外高效表达分泌型的内皮抑素蛋白。二.内皮抑素腺病毒载体转染可抑制内皮细胞增殖并阻断VEGF;65对内皮细胞 的生长促进作用，作用为正性量效关系，并对内皮细胞特异，对肿瘤细胞无 影响。三.内皮抑素可使ECV304内皮细胞Gl期阻滞并诱导其凋亡。四.内皮抑素腺病毒