背景:甲状腺乳头状癌是甲状腺癌中最常见的病理类型。近年来,发病率逐渐升高,PTC的精准诊断和选择合适的个体化治疗方式是目前临床医生的较大挑战。蛋白质是生命活动的重要物质基础,是细胞增殖、分化、衰老和死亡等生命活动的主要执行者。与基因组学、转录组学、代谢组学不同,蛋白质组学以蛋白质为研究对象,通过分析蛋白质水平的变化情况阐明潜在的分子机制。NPC2是一种在溶酶体内的小分子可溶性蛋白,主要参与调控细胞内胆固醇转运过程。研究表明,除了在阿尔兹海默症等神经系统疾病,其在胃癌、肝脏肿瘤、脑胶质瘤的发生发展中可能发挥一定的调控作用,但在甲状腺癌中的作用和分子机制尚不明确。方法:首先,于我院甲状腺外科收集行初次手术的PTC病人的组织标本,通过基于i TRAQ-TMT的质谱分析方法进行蛋白质组学测序。采用KEGG、Mfuzz、PPI等一系列生物信息学方法筛选具有潜在临床意义的DEP。经PRM验证后,通过机器学习及Nomogram方法确定具有一定诊断效能的biomarkers。其次,在TCGA、GETs、c Bio Portal及CTPAC等数据库中进行NPC2的泛癌分析,基于TIMER、EPIC、QUENTISEQ、STRING、Gene MANIA、WGCNA等方法进行详尽的生物信息学分析。另外,采用q PCR、Western blot、CCK-8、流式细胞术、Transwell实验、免疫荧光等方法在TPC-1细胞模型中验证NPC2的生物学功能。最后,进一步扩大样本量收集临床标本,通过q PCR及IHC方法评估NPC2表达与PTC病人临床病理特征之间相关性。结果:1、基于蛋白质组学测序和机器学习探究甲状腺癌的biomarkers首先,基于蛋白质测序结果,分别从肿瘤-正常对比组或N1-N0对比组中共鉴定DEPs 5203个。Mfuzz分析结果显示,从癌旁、无淋巴转移的甲状腺癌到发生淋巴转移的甲状腺癌,各比较组DEPs所富集的信号通路与甲状腺癌疾病进展密切相关。PPI分析结果显示,这些DEPs主要富集在以下代谢相关信号通路:胆固醇代谢、丙酮酸代谢、三羧酸循环、PI3K-Akt途径和甲状腺激素合成等。进一步,扩大样本量收集验证队列的组织标本（20对）,PRM验证结果显示,18/20个靶标蛋白与测序结果一致,且部分目标蛋白的表达水平与PTC淋巴结转移相关。对验证成功的DEPs进行机器学习,结果显示PDLIM4、ANXA1、PKM、NPC2和LMNA能够很好地区分甲状腺良恶性结节,而FN1在鉴别是否发生淋巴结转移时的效能尚可,AUC为0.690。最后,基于TCGA数据库,如下5个经PRM验证的蛋白与PTC预后相关:FN1、IDH2、VDAC1、FABP4和TG,且以此建立的Nomogram模型能够较好地预测预后,一致性指数为0.685（置信区间:0.645-0.726）。2、基于生物信息学分析方法探讨NPC2在甲状腺癌及泛癌中的作用为了进一步探讨甲状腺癌发生淋巴结转移的分子机制,我们首先将TCGATHCA数据库中的病人分为N0组及N1组,以Fold-change＞1.3或＜0.7为截断值筛选出DEGs。WGCNA分析结果显示,black module与PTC的发生发展相关,此基因集中的DEGs与PTC进展具有较好的一致性,主要包括:NPC2、KLHDC8A、METTL7B、ETV4、LRP4、LIPH等。基于以上系列研究,我们将NPC2作为后续的主要研究对象。在TCGA及GTEx数据库中针对NPC2进行甲状腺癌的系统生物信息学分析。结果显示,与癌旁组织相比,NPC2在PTC中表达量较高,在Stage III及Stage IV分期中表达量高于Stage II,且PTC低表达与OS高相关。进一步,我们在TCGA、GTEs、CPTAC及c Bio Portal等数据库对NPC2进行多肿瘤的泛癌生物信息学分析。结果显示,NPC2在多种肿瘤中差异表达,且与肿瘤生存率（OS）相关。重要的是,在TIMER、EPIC、QUENTISEQ等免疫相关数据库分析结果显示,NPC2主要与MHC及免疫刺激因子呈正相关。与NPC2相互作用基因主要富集在溶酶体、胆固醇代谢、自噬等通路中。提示,NPC2可能通过免疫微环境调控肿瘤的发生发展及预后。3、NPC2在甲状腺癌发生发展中的生物学功能为了进一步验证NPC2在甲状腺癌发生发展中的生物学功能,我们选取NPC2表达量较高的甲状腺乳头状癌细胞系TPC-1作为主要的实验对象。首先,应用sh RNA技术在TPC-1中构建细胞模型。结果显示,在m RNA水平三个质粒均可显著降低NPC2的表达;而在蛋白质水平,sh NPC2-1的敲除率高达70%以上,因此选择该细胞模型进行后续的功能实验。CCK-8及克隆形成结果显示,与sh NC组相比,NPC2敲低可以显著降低TPC-1的细胞增殖能力。流式细胞术检测细胞凋亡水平,结果显示,NPC2敲低可明显抑制Cis和Rapa诱导的凋亡水平增加。另外,NPC2敲低还可抑制G2/M期阻滞。Transwell结果显示,与sh NC组相比,NPC2敲低可以显著抑制TPC-1的细胞迁移及细胞侵袭能力。以上结果提示,NPC2可能参与调控甲状腺癌的细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期、细胞迁移及侵袭能力。4、NPC2表达与甲状腺癌病人的临床病理特征相关性分析为了进一步验证NPC2表达情况与临床病理特征的相关性,我们重新收集PTC病人的甲状腺癌组织标本及临床基本资料（N=47例）。分别通过IHC观察NPC2蛋白质表达水平,以及应用q PCR检测其m RNA表达水平。q PCR结果显示,与癌旁组织相比,NPC2在癌组织中高表达。绘制ROC曲线评估NPC2对甲状腺结节良恶性的诊断效能,结果显示AUC=0.875,95%CI:0.754～0.996。IHC结果显示,与癌旁组织相比NPC2在癌组织中高表达。将同一病人癌组织及癌旁组织的IHC得分进行比值,将Ratio≥2定义为相对高表达组,反之,定义为相对低表达组。结果显示,与NPC2相对低表达组相比,在NPC2相对高表达组中,PTC的肿瘤直径更长,肿瘤内更易出现钙化。提示NPC2的表达可能与甲状腺癌病人的临床病理特征相关。结论:1、基于蛋白质组学和机器学习探究甲状腺癌的biomarkers（1）在蛋白质水平上,甲状腺癌的发生发展可能与以下代谢信号通路相关:胆固醇代谢、丙酮酸代谢、三羧酸循环、PI3K-Akt途径和甲状腺激素合成等。（2）基于机器学习的筛选,如下蛋白质可以作为诊断甲状腺良恶性的潜在标志物:PDLIM4、ANXA1、PKM、NPC2、LMNA和FN1。（3）基于5种蛋白的Nomogram模型（FN1、IDH2、VDAC1、FABP4和TG）可以较好地预测甲状腺癌病人的预后。2、基于生物信息学分析方法探讨NPC2在甲状腺癌中的作用（1）基于WGCNA分析,black module与甲状腺癌的发生发展相关,主要基因包括:NPC2、KLHDC8A、METTL7B、ETV4、LRP4、LIPH等。（2）基于生物信息学分析方法证实NPC2在甲状腺癌组织中高表达,且与OS相关。与NPC2相互作用基因主要富集在溶酶体、胆固醇代谢、自噬等通路中。（3）NPC2在不同肿瘤的泛癌组织中差异表达,且与多种肿瘤的生存率（OS）相关。另外,NPC2可能通过免疫微环境调控甲状腺癌的发生发展及预后。3、NPC2在甲状腺癌发生发展中的生物学功能（1）NPC2在大多数甲状腺癌细胞系中高表达,选取TPC-1作为主要的研究对象,并成功建立了NPC2敲低的细胞模型。（2）NPC2敲低可以显著抑制TPC-1的细胞增殖能力,抑制Cis和Rapa诱导的凋亡水平增加,抑制G2/M期阻滞,同时显著抑制TPC-1的细胞迁移及细胞侵袭能力。4、NPC2表达与甲状腺癌临床病理特征的相关性分析（1）在临床组织标本中,应用q PCR的方法在m RNA水平证实了NPC2在肿瘤组织中的高表达。（2）通过免疫组化在蛋白质水平证实了NPC2在甲状腺癌中的高表达。（3）NPC2相对高表达可能与肿瘤直径及肿瘤钙化等临床病理特征相关。