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目的:肝癌是一类侵袭性强、死亡率高,对临床治疗反应差的恶性肿瘤,目前临床上缺乏有效治疗手段。近年来,肿瘤来源的exosome（TEX）作为抗原有效载体在肿瘤免疫治疗中取得可喜进展,本实验室在前期工作中,证明TEX可作为肝癌抗原的有效运输载体,促进树突状细胞成熟和活化,从而在荷瘤小鼠上介导有效的抑瘤作用。然而,针对肝癌的复杂免疫微环境,亟需研发能够进一步提高树突状细胞免疫原性的新策略。有研究表明:预警素,特别是high mobility group nucleosome-binding protein 1（HMGN1）,具有招募树突状细胞（DC）及促进树突状细胞活化的作用,被广泛用作新型的免疫佐剂,但其在肝癌免疫治疗中的应用潜力有待研究。因此,在本研究中,拟利用基因工程及本实验室创建的exosomes功能化修饰平台,在肝癌体外、体内模型上,系统研究HMGN1在肝癌免疫治疗中的可行性及潜力。方法:通过慢病毒转染肝癌Hepa1-6细胞系,以获得稳定表达HMGN1蛋白的Hepa1-6细胞(Hepa1-6HMGN1);通过比较Hepa1-6HMGN1细胞与Hepa1-6细胞在体内外生长速率,以确定HMGN1蛋白对肿瘤细胞生长的影响。利用透射电镜、nanosight、Western blotting和流式细胞术等,来表征蔗糖密度梯度离心纯化回收的肝癌细胞来源exosome的形态、大小和密度及表面不同标志蛋白的表达。利用新型exosome锚定肽（CP05）,将HMGN1功能短肽N1ND负载于肝癌细胞来源的exosome上（N1ND-TEX）,在体外和皮下、原位小瘤、大瘤小鼠肝癌模型上,系统评估N1ND-TEX冲击的树突状细胞的成熟、活化和体内抑瘤作用。进而通过流式细胞术、ELISA及免疫组化染色等方法,实时评估治疗组荷瘤小鼠外周血和肿瘤免疫微环境的动态变化情况。为揭示N1ND-TEX增强树突状细胞免疫原性的作用机制,利用诱导记忆T细胞产生和基因敲除下调N1ND活化树突状细胞信号通路中的关键基因表达及Western blotting等手段,以明确N1ND-TEX作用通路。并利用Western blotting方法,来检测肝癌病人组织样中HMGN1的表达,以明确HMGN1介导的DC细胞治疗的临床相关性。结果:与Hepa1-6细胞相比,Hepa1-6HMGN1细胞在生长速率无显著变化,但在皮下接种小鼠后,表现为成瘤性和生长速率显著降低,说明HMGN1蛋白表达上调后能够抑制肿瘤生长。对蔗糖密度梯度离心纯化后的TEX表征的结果显示:TEX呈均一茶杯样,直径在30-100nm的囊泡结构,表达各种exosome标记蛋白。在体外,N1ND-TEX冲击的DC,与TEX冲击的DC相比,前者能够显著提高DC表面免疫相关功能蛋白的表达,促进DC成熟和活化并能增其刺激T细胞活化的作用。负载N1ND-TEX的DC(DCN1ND-TEX)能够抑制肝癌皮下瘤和原位瘤小鼠模型上肿瘤生长,延长荷瘤小鼠生存期,并改善其免疫及肿瘤微环境。尤其在形成免疫抑制性微环境的中晚期原位肝癌小鼠模型上,与DCTEX相比,DCN1ND-TEX表现出更强的持续性抑瘤效果,重塑肝癌免疫和肿瘤微环境。对DCN1ND-TEX介导的持续抑瘤效果作用机制的阐释,结果发现:N1ND通过Toll like receptor 4（TLR4）介导和增强DC活化,增强DC的归巢作用,进而诱导和活化更多记忆T细胞的生成,达到持续的抑瘤作用。而且,将N1ND负载于不同肿瘤细胞来源的exosome上,冲击DC后,与相应exosome冲击的DC相比,能介导更有效的肿瘤细胞杀伤效应,说明N1ND具有普适性。对肝癌病人临床组织样品中HMGN1蛋白的检测,结果表明:与癌旁组织相比,肝癌组织中HMGN1蛋白的表达明显降低,为HMGN1作为新型免疫佐剂在肝癌免疫治疗中的应用提供了理论治疗和临床依据。结论:1.预警素HMGN1能够抑制肝癌细胞的生长。2.肿瘤细胞来源的exosome可作为HMGN1功能短肽N1ND的有效生物纳米运输载体。3.TEX-N1ND能够更有效地促进DC成熟、活化和归巢及活化T细胞能力。4.在不同的肝癌小鼠模型上,DCTEX-N1ND表现出更有效的、持续性抑瘤作用,延长荷瘤小鼠生存期,改善免疫和肿瘤微环境。5.N1ND-TEX通过介导DC更强的归巢作用,诱导活化更多记忆T细胞,从而产生更有效的可持续性抑瘤作用。