目的:肺癌是发病率和死亡率增长最快,对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近年来多个国家报道肺癌的发病率和死亡率均在明显增高,男性肺癌发病率和死亡率占所有恶性肿瘤的第一位,女性发病率和死亡率占第二位,其中非小细胞肺癌占据肺癌发生的83%。大部分临床三期和四期的非小细胞肺癌病人接受化疗或放化疗联合治疗。紫杉醇是一种微管抑制剂,通常作为恶性非小细胞肺癌病人单一药物治疗或辅助治疗药物。紫杉醇能够直接作用于细胞分裂过程中组成纺锤体的微管蛋白,与多聚β-Tubulin结合,从而干扰微管动态平衡,防止其解聚。结果,细胞被纺锤体检查点阻滞在G2/M期,无法完成复制,最终经历程序性细胞凋亡过程而死亡。已有研究报道多种细胞内信号调节通路参与了紫杉醇诱导的细胞毒性,包括RAS,MYC依赖的信号途径以及非受体型酪氨酸激酶途径。但是,由于临床治疗的复杂性,关于紫杉醇药物发挥作用更多的分子机制尚需要进一步探究。大约95%的人类基因会发生RNA可变剪接,可变剪接是基因调控的一个重要步骤。前体mRNA经过可变剪接能够产生多种形式的成熟mRNA,并最终翻译成结构和功能多样的蛋白质。可变剪接的失调会导致多种异常的剪接本及蛋白异构体的产生,进而引发肿瘤的发生发展和治疗上的困难。有研究显示,在非小细胞肺癌中,蛋白剪接因子如SRSF1,SRSF2,SRPK1和SRPK2发生异常表达。此外,使用RNA寡聚核苷酸可以调整Caspase 9 pre-mRNA的剪接趋向于产生Caspase 9b剪接本,增加非小细胞肺癌细胞对紫杉醇的敏感性。在三阴性乳腺癌紫杉醇耐药细胞株发现RNA剪接异常,其中TRA2A与剪接因子hnRNPM相互作用共同调控了剪接。这些数据说明,化疗药物紫杉醇可以通过调控癌症相关基因的异常剪接杀死癌症细胞。但是关于紫杉醇诱导可变剪接的调控其具体分子机制仍然不是很清楚。方法:1.MTT法检测使用梯度浓度的紫杉醇处理A549和H1299细胞后,使用Graphad Prism6计算得到48 h药物的IC50值。2.使用梯度浓度的紫杉醇处理A549和H1299细胞24 h,xCELLigence real-time cell analysis(RTCA)和平板克隆实验检测紫杉醇对细胞增殖和生存能力的影响。3.使用(5,10,20 nM药物浓度处理A549细胞;20,50,70 nM药物浓度处理H1299细胞)药物处理细胞12 h,流式细胞仪检测细胞周期阻滞情况。4.药物处理24 h,Anexin V/PI检测药物诱导细胞凋亡情况。5.IC5O值药物浓度处理A549,采用高通量测序技术检测药物引起基因表达变化,qPCR验证基因表达情况。6.高通量测序技术检测药物引起转录变化,RT-PCR验证剪接变化。7.gene ontology对紫杉醇诱导基因表达及转录组变化进行功能性分析。8.STRING分析紫杉醇诱导的基因表达和转录组变化参与的细胞内蛋白相互作用网络。9.Western blot检测细胞内过表达ECT2剪接本蛋白表达水平。10.免疫荧光检测ECT2剪接本细胞定位情况。结果:1.我们通过RTCA方法实时检测细胞,发现紫杉醇能够抑制A549和H1299细胞增殖以及迁移能力,平板克隆实验表明细胞的生长受到显著的抑制,并呈药物浓度梯度依赖的趋势。2.使用流式细胞仪分析细胞周期和凋亡情况,结果表明不同浓度的紫杉醇处理后,细胞周期阻滞,停留在G2/M期;随着时间的延长,紫杉醇诱导细胞产生凋亡,并且在最大浓度时,10%左右的细胞发生凋亡。3.高通量测序技术数据分析结果显示,紫杉醇诱导细胞内944个基因表达的发生显著变化,GO分析紫杉醇参与了DNA复制,由P53介导的DNA损伤修复反应,染色体重组及有丝分裂G2/M期的转变。4.qPCR验证CDKN1A,AURKA,GADD45A,FOXM1等基因包括剪接因子hnRNPUL1 mRNA水平变化。5.紫杉醇可以诱导广泛的剪接调控的改变,855个剪接事件的变化包括外显子跳读,内含子保留,选择性5’端剪接,选择性3’端剪接和互斥剪接。6.紫杉醇诱导剪接事件的改变调控了细胞内DNA损伤反应,内质网膜上GPI受体组装,转录,DNA修复和细胞周期等通路的调控。7.鉴定到ECT2,FMNL3,ZMIN2,ELF2,DDIT3和PLD2在紫杉醇处理后长短剪接本的变化。8.成功构建了ECT2长短剪接本稳定过表达的A549和H1299细胞株,ECT2-S稳转细胞与对照相比,增殖减缓。9.IC50值药物浓度处理A549和H1299稳转细胞发现,ECT2-S稳转细胞与对照相比,细胞活力及细胞生长减慢。10.IC50值药物浓度处理A549和H1299稳转细胞后观察ECT2-L/S定位发生改变,ECT2-S核内与胞质均匀定位,而ECT2-L主要定位在细胞核。11.RT-PCR检查到在癌组织中ECT2长剪接本增多,癌组织与正常组织相比PSI值升高,数据统计分析有显著差异。12.TCGA数据库分析在乳癌,卵巢癌,肺癌及胃癌中ECT2的表达与生存期呈负相关。结论:紫杉醇能够抑制细胞增殖,诱导细胞周期阻滞在G2/M期,诱导细胞凋亡。紫杉醇引起细胞周期调控,DNA损伤等相关基因表达变化;紫杉醇诱导可变剪接的调控,并参与多种生物学途径;鉴定得到ECT2长短剪接本对细胞增殖能力的影响,并影响对紫杉醇的药物反应,为肺癌临床联合用药提供了新的思路。目的:RNA可变剪接,即选择性使用pre-m RNA中的剪接位点,使一个基因能够产生多种剪接本,进而改变编码蛋白的的序列组成和功能。可变剪接的可塑性使癌症蛋白质组更丰富多样,有利于癌症细胞产生适应生存需求的蛋白质并得以扩散。癌症中多种生物学途径会受到可变剪接的影响,例如代谢,凋亡,细胞周期控制,侵袭迁移以及血管生成。由于剪接位点的突变,剪接调节元件的突变和表达变化使癌症细胞通常展示出异常的可变剪接图谱。越来越多的研究报道在恶性血液性疾病,肺癌和乳腺癌中反复出现的剪接因子的突变,使得研究癌症中剪接异常成为潜在的治疗靶点。真核生物中核心剪接元件同相关的剪接因子共同组成了庞大的剪接体系,剪接调控因子被分为许多不同的家族,通常为SR和hn RNP蛋白家族。这其中还包括一类含有RNA识别基序(RRM)的RBM蛋白家族。RBM家族成员通常含有一至多个保守的RRM区域,这一区域跨越80-100个氨基酸。结构分析,RRM通常含有4个β折叠和2个α螺旋。实质上,RBM家族蛋白作为hn RNP的组分结合到pre-m RNA调控剪接,作为sn RNP的一部分参与了RNA稳定性和翻译过程的调控。但大部分的RBM蛋白主要调控pre-m RNA可变剪接过程。RBM25属于RNA结合蛋白家族,结构包含共同的精氨酸-谷氨酸富集(RErich)核心区及结合到RNA上的C端PWI区域,RE-rich domain有利于RBM25定位于剪接因子富集的核小体周围。RBM25与多种剪接组分如SRm160/300,U sn RNAs相互作用组装剪接体复合物并调控剪接。RBM25与U1 sn RNP相关剪接因子h Luc7A相互作用激活了促凋亡因子Bcl-x 5’剪接位点的使用,调控了细胞凋亡。最新的研究发现,RBM25调控了人类基因组内大部分选择性外显子的保留,并与早期剪接体的组分SF3B及多种剪接调节因子相互作用。在多种人类细胞中,RBM25第77位赖氨酸发生甲基化,当这一区域不发生甲基化时其与SRSF2的亲和力增强,这些发现为RBM25调控可变剪接揭示了新的作用和机制。我们研究发现RBM25的下调会抑制肺癌细胞的增殖和迁移能力,RNA-seq测序结果显示RBM25参与了多种剪接事件的调控,包括外显子跳读,内含子保留和剪接位点的选择等。因此,探究RBM25抑制细胞增殖和迁移的分子机制,在肺癌中的剪接调控作用可以为肺癌的治疗提供更多的可能。方法:1.构建H1299和A549 RBM25稳转过表达及敲降细胞系,使用重组慢病毒感染细胞,嘌呤霉素筛选后低浓度维持。2.Western blot验证RBM25高表达及敲降效率。3.RTCA和平板克隆实验检测稳转细胞的增殖和生存能力。4.RTCA和划痕实验检测稳转细胞迁移能力的变化。5.实时定量PCR检测肺癌组织内RBM25表达情况。6.免疫荧光实验观察RBM25在293T细胞内定位。7.普通光学显微镜观察RBM25敲降细胞的形态学变化。8.RNA-seq测序探究RBM25对肺癌细胞的剪接调控作用。9.Gene Ontology对RBM25剪接调控进行功能性分析。10.STRING分析RBM25剪接调控相互作用网络。结果:1.成功构建了RBM25稳定敲降H1299和A549细胞。2.和对照组细胞相比,稳定敲降RBM25细胞,RBM25胞内蛋白表达明显降低。3.RTCA和平板克隆结果显示,敲降细胞生长受到明显抑制。4.RBM25在敲降后迁移及运动能力明显受到了抑制。5.与正常组织相比,RBM25在肺癌组织内普遍高表达6.免疫荧光结果显示,RBM25定位于核内。7.RBM25敲降后细胞形态更加细长。8.RBM25调控细胞内多种剪接事件,包括外显子跳读,内含子保留和5’和3’剪接位点剪接。9.GO功能分析发现RBM25主要调控pre-m RNA剪接,RNA加工过程。10.RBM25调控基因剪接事件的主要相互作用网络是剪接体相关剪接调控和m RNA加工代谢过程中的无义降解。结论:RBM25抑制肺癌细胞增殖和迁移能力,RBM25可以调控癌症内可变剪接,这为肺癌的治疗提供了新的靶点。