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肿瘤在发生过程中会伴随多种物理作用力的变化，包括固体应力、流体剪切力和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）刚度等。这些力持续作用于肿瘤组织内的癌细胞，并影响它们的行为。近年来，肿瘤组织中的力学因素，特别是基质刚度，已经成为与癌症发生发展相关的一个重要因素。肝癌作为人类最常见的实体肿瘤之一，在其进程中也具有细胞外基质刚度增加的典型特征。研究表明，细胞外基质刚度在调节肝癌细胞行为方面起着重要作用。但其中涉及的力学生物学机制还知之甚少。
代谢重编程是癌细胞的主要特征之一。有氧糖酵解（Warburg效应）是癌细胞能量供应的主要方式。当细胞受到外界物理或化学因素刺激时细胞会发生代谢重编程以满足其生物学行为变化的能量需求。作为癌症的两大特征，最近的一些研究发现细胞外基质刚度增加和代谢重编程之间存在联系。细胞外基质刚度增加和有氧糖酵解对肝癌细胞生物学行为的影响都已有大量研究证明。但细胞外基质刚度如何通过调控其代谢满足肝癌细胞生物学行为的能量需求以及其中涉及的力信号转导（mechanotransduction）机制还不清楚。从细胞代谢角度出发，深入探究肝癌发生发展过程中基质刚度对细胞生物学行为调控的机制，对于寻求新的肝癌干预策略具有重要意义。
本文选用通常用于体外模拟细胞外基质刚度变化的聚丙烯酰胺水凝胶，制备了三种刚度（6，25和54kPa）的基质胶，分别用于模拟正常肝组织、肝硬化的肝组织和肝癌组织的硬度。以人肝癌细胞（HepG2和MHCC97L）为研究对象，探讨了细胞外基质刚度对肝癌细胞迁移和糖酵解代谢的影响和相关的分子机制，为从代谢角度了解基质刚度影响肝癌细胞迁移的机理提供理论支持。主要实验结果如下：
①细胞外基质刚度调控肝癌细胞的糖酵解代谢进而调控其迁移
将两种肝癌细胞HepG2和MHCC97L接种在三种刚度的聚丙烯酰胺水凝胶上，48小时后分别通过划痕实验和transwell实验检测了基质刚度对HepG2和MHCC97L细胞迁移能力的影响。结果显示，两种肝癌细胞的迁移能力都随基质刚度的增加而增强。qRT-PCR和western bolt检测糖酵解相关酶基因水平和蛋白表达的结果显示，随基质刚度的增加，两种肝癌细胞的葡萄糖转运蛋白1（glucose transporter1，Glut1）、己糖激酶Ⅱ（hexokinaseⅡ，HKⅡ）和乳酸脱氢酶A（lactate dehydrogenase A，LDHA）的表达都显著增加，并且葡萄糖消耗和乳酸产量也随基质刚度的增加而增加。因此，基质刚度可以调控肝癌细胞的糖酵解代谢和迁移能力。利用两条特异性的siRNA敲减肝癌细胞HepG2和MHCC97L中的HKⅡ后，transwell实验的结果显示，肝癌细胞在较硬基质上的迁移能力受到显著抑制，恢复到与6kPa相当的水平。上述结果表明，细胞外基质刚度通过影响肝癌细胞的糖酵解代谢调控其迁移能力。
②基质刚度通过Yes相关蛋白（Yes-associated protein，YAP）调控肝癌细胞的糖酵解代谢
YAP作为力感受因子和力转导因子能够将细胞外的力学刺激转化为细胞内的生物化学信号调控细胞的生理生化过程。将肝癌细胞HepG2和MHCC97L接种在三种刚度的聚丙烯酰胺水凝胶上，48小时后通过western bolt检测总的YAP和磷酸化YAP（p-YAP）的表达情况。结果显示，随基质刚度增加，两种肝癌细胞中的总的YAP表达增加，而p-YAP/YAP的比值显著减小。免疫荧光（Immunofluorescence，IF）的结果显示，随基质刚度的增加YAP从细胞质向细胞核转移。此外，通过qRT-PCR检测YAP下游靶基因CYR61和CTGF的表达情况，实验结果显示，随基质刚度的增加，CYR61和CTGF的表达显著增加。上述结果表明，肝癌细胞YAP的表达和活性随细胞外基质刚度增加而增加。
为了确定YAP在基质刚度对肝癌细胞糖酵解代谢调控中的作用，利用两条特异性的siRNA敲减了肝癌细胞HepG2和MHCC97L中的YAP。YAP敲减后，通过qRT-PCR和western bolt检测糖酵解相关酶基因水平和蛋白表达的结果显示，较硬基质上培养的两种肝癌细胞中糖酵解相关酶在基因水平和蛋白水平的表达都显著下调；并且，在较硬基质上培养的两种肝癌细胞的葡萄糖消耗、乳酸产量与对照组相比都显著降低。因此，细胞外基质刚度通过YAP信号调控肝癌细胞的糖酵解代谢。
③基质刚度通过JNK和p38MAPK通路调控YAP表达和活性进而调控肝癌细胞迁移
Hippo通路不是调控YAP的唯一通路，YAP还可能受到细胞内其他信号通路的调控作用。最近有研究显示力学刺激可以通过丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路调控YAP活性。通过western bolt检测总的细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、c-jun氨基末端激酶（c-Jun N-amino-terminal kinase，JNK）、p38MAPK和磷酸化的ERK1/2、JNK、p38MAPK（p-ERK1/2、p-JNK、p-p38）在不同基质刚度上培养的肝癌细胞HepG2和MHCC97L中的表达情况。结果显示，p-ERK/ERK，p-JNK/JNK，p-p38/p38在两种肝癌细胞中都随基质刚度的增加而增加。利用ERK1/2、JNK或p38MAPK通路抑制剂处理后通过western bolt检测YAP表达情况。结果显示，JNK和p38MAPK通路抑制剂能够显著抑制较硬基质刚度上两种肝癌细胞中YAP的表达，而ERK1/2通路抑制剂处理对YAP的表达没有明显作用。免疫荧光的结果显示，JNK和p38MAPK通路抑制剂后较硬基质刚度上两种肝癌细胞中YAP的荧光强度与对照组相比明显降低，而ERK1/2通路抑制剂处理对YAP的表达没有明显作用。通过qRT-PCR检测了ERK1/2、JNK或p38MAPK通路抑制剂处理后，YAP下游靶基因CYR61和CTGF的表达情况。结果显示，JNK和p38MAPK通路抑制剂处理后较硬基质刚度上两种肝癌细胞中CYR61和CTGF的表达与对照组相比都显著下降，而ERK1/2抑制剂处理后与对照组相比没有明显差异。这些结果表明，细胞外基质刚度通过JNK和p38MAPK通路调控YAP信号。
敲减YAP以及使用JNK或p38MAPK通路抑制剂处理后检测不同基质刚度上肝癌细胞的迁移情况，结果显示，无论是敲减YAP还是JNK或p38MAPK通路抑制剂处理都会显著抑制较硬基质上两种肝癌细胞的迁移。表明，YAP、JNK和p38MAPK在基质刚度增加促进肝癌细胞的迁移中都起到重要作用。
综合上述结果，本文得出的结论是细胞外基质刚度增加通过MAPK-YAP介导的力信号转导促进肝癌细胞有氧糖酵解并进一步促进其迁移。本研究结果为深入了解细胞外基质刚度在调控肝癌细胞有氧糖酵解代谢和迁移能力中的作用及其力学生物学机制提供了实验依据，为临床上肝癌的治疗提供了理论指导。
代谢重编程是癌细胞的主要特征之一。有氧糖酵解（Warburg效应）是癌细胞能量供应的主要方式。当细胞受到外界物理或化学因素刺激时细胞会发生代谢重编程以满足其生物学行为变化的能量需求。作为癌症的两大特征，最近的一些研究发现细胞外基质刚度增加和代谢重编程之间存在联系。细胞外基质刚度增加和有氧糖酵解对肝癌细胞生物学行为的影响都已有大量研究证明。但细胞外基质刚度如何通过调控其代谢满足肝癌细胞生物学行为的能量需求以及其中涉及的力信号转导（mechanotransduction）机制还不清楚。从细胞代谢角度出发，深入探究肝癌发生发展过程中基质刚度对细胞生物学行为调控的机制，对于寻求新的肝癌干预策略具有重要意义。
本文选用通常用于体外模拟细胞外基质刚度变化的聚丙烯酰胺水凝胶，制备了三种刚度（6，25和54kPa）的基质胶，分别用于模拟正常肝组织、肝硬化的肝组织和肝癌组织的硬度。以人肝癌细胞（HepG2和MHCC97L）为研究对象，探讨了细胞外基质刚度对肝癌细胞迁移和糖酵解代谢的影响和相关的分子机制，为从代谢角度了解基质刚度影响肝癌细胞迁移的机理提供理论支持。主要实验结果如下：
①细胞外基质刚度调控肝癌细胞的糖酵解代谢进而调控其迁移
将两种肝癌细胞HepG2和MHCC97L接种在三种刚度的聚丙烯酰胺水凝胶上，48小时后分别通过划痕实验和transwell实验检测了基质刚度对HepG2和MHCC97L细胞迁移能力的影响。结果显示，两种肝癌细胞的迁移能力都随基质刚度的增加而增强。qRT-PCR和western bolt检测糖酵解相关酶基因水平和蛋白表达的结果显示，随基质刚度的增加，两种肝癌细胞的葡萄糖转运蛋白1（glucose transporter1，Glut1）、己糖激酶Ⅱ（hexokinaseⅡ，HKⅡ）和乳酸脱氢酶A（lactate dehydrogenase A，LDHA）的表达都显著增加，并且葡萄糖消耗和乳酸产量也随基质刚度的增加而增加。因此，基质刚度可以调控肝癌细胞的糖酵解代谢和迁移能力。利用两条特异性的siRNA敲减肝癌细胞HepG2和MHCC97L中的HKⅡ后，transwell实验的结果显示，肝癌细胞在较硬基质上的迁移能力受到显著抑制，恢复到与6kPa相当的水平。上述结果表明，细胞外基质刚度通过影响肝癌细胞的糖酵解代谢调控其迁移能力。
②基质刚度通过Yes相关蛋白（Yes-associated protein，YAP）调控肝癌细胞的糖酵解代谢
YAP作为力感受因子和力转导因子能够将细胞外的力学刺激转化为细胞内的生物化学信号调控细胞的生理生化过程。将肝癌细胞HepG2和MHCC97L接种在三种刚度的聚丙烯酰胺水凝胶上，48小时后通过western bolt检测总的YAP和磷酸化YAP（p-YAP）的表达情况。结果显示，随基质刚度增加，两种肝癌细胞中的总的YAP表达增加，而p-YAP/YAP的比值显著减小。免疫荧光（Immunofluorescence，IF）的结果显示，随基质刚度的增加YAP从细胞质向细胞核转移。此外，通过qRT-PCR检测YAP下游靶基因CYR61和CTGF的表达情况，实验结果显示，随基质刚度的增加，CYR61和CTGF的表达显著增加。上述结果表明，肝癌细胞YAP的表达和活性随细胞外基质刚度增加而增加。
为了确定YAP在基质刚度对肝癌细胞糖酵解代谢调控中的作用，利用两条特异性的siRNA敲减了肝癌细胞HepG2和MHCC97L中的YAP。YAP敲减后，通过qRT-PCR和western bolt检测糖酵解相关酶基因水平和蛋白表达的结果显示，较硬基质上培养的两种肝癌细胞中糖酵解相关酶在基因水平和蛋白水平的表达都显著下调；并且，在较硬基质上培养的两种肝癌细胞的葡萄糖消耗、乳酸产量与对照组相比都显著降低。因此，细胞外基质刚度通过YAP信号调控肝癌细胞的糖酵解代谢。
③基质刚度通过JNK和p38MAPK通路调控YAP表达和活性进而调控肝癌细胞迁移
Hippo通路不是调控YAP的唯一通路，YAP还可能受到细胞内其他信号通路的调控作用。最近有研究显示力学刺激可以通过丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路调控YAP活性。通过western bolt检测总的细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、c-jun氨基末端激酶（c-Jun N-amino-terminal kinase，JNK）、p38MAPK和磷酸化的ERK1/2、JNK、p38MAPK（p-ERK1/2、p-JNK、p-p38）在不同基质刚度上培养的肝癌细胞HepG2和MHCC97L中的表达情况。结果显示，p-ERK/ERK，p-JNK/JNK，p-p38/p38在两种肝癌细胞中都随基质刚度的增加而增加。利用ERK1/2、JNK或p38MAPK通路抑制剂处理后通过western bolt检测YAP表达情况。结果显示，JNK和p38MAPK通路抑制剂能够显著抑制较硬基质刚度上两种肝癌细胞中YAP的表达，而ERK1/2通路抑制剂处理对YAP的表达没有明显作用。免疫荧光的结果显示，JNK和p38MAPK通路抑制剂后较硬基质刚度上两种肝癌细胞中YAP的荧光强度与对照组相比明显降低，而ERK1/2通路抑制剂处理对YAP的表达没有明显作用。通过qRT-PCR检测了ERK1/2、JNK或p38MAPK通路抑制剂处理后，YAP下游靶基因CYR61和CTGF的表达情况。结果显示，JNK和p38MAPK通路抑制剂处理后较硬基质刚度上两种肝癌细胞中CYR61和CTGF的表达与对照组相比都显著下降，而ERK1/2抑制剂处理后与对照组相比没有明显差异。这些结果表明，细胞外基质刚度通过JNK和p38MAPK通路调控YAP信号。
敲减YAP以及使用JNK或p38MAPK通路抑制剂处理后检测不同基质刚度上肝癌细胞的迁移情况，结果显示，无论是敲减YAP还是JNK或p38MAPK通路抑制剂处理都会显著抑制较硬基质上两种肝癌细胞的迁移。表明，YAP、JNK和p38MAPK在基质刚度增加促进肝癌细胞的迁移中都起到重要作用。
综合上述结果，本文得出的结论是细胞外基质刚度增加通过MAPK-YAP介导的力信号转导促进肝癌细胞有氧糖酵解并进一步促进其迁移。本研究结果为深入了解细胞外基质刚度在调控肝癌细胞有氧糖酵解代谢和迁移能力中的作用及其力学生物学机制提供了实验依据，为临床上肝癌的治疗提供了理论指导。